Kanatlı hayvanlarda yaygın olarak görülen viral ve bakteriyel patojenlerin multipleks PCR tabanlı hızlı tanısı için kit geliştirilmesi
Development of a multiplex PCR-based test kit for the rapid diagnosis of common viral and bacterial pathogens in poultry
- Tez No: 941860
- Danışmanlar: DOÇ. DR. BİLGE KAAN TEKELİOĞLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Kanatlı hayvanlar, RT-PCR, tanı kiti, Poultry, real-time PCR, diagnostic kit
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Çukurova Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 95
Özet
Kanatlı hayvan hastalıklarının hızlı teşhisi, tedavi, kontrol ve biyogüvenlik açısından önemlidir. Bu tez çalışmasında, birden fazla patojeni aynı anda tespit edebilen Multipleks PCR temelli tanı kitinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. İnfeksiyöz Laringotracheit hastalığı (ILT - GaHV-1), Newcastle Hastalığı Virüsü (NDV), Avian İnfluenza Virüsü alt tipleri (AIV'ler – A/H5N1, A/H9N2, A/H7N9), E.coli. ve E.coli O157:H7, Salmonella spp. ve Pasteurella multocida ilgili patojenler olarak belirlenerek herbirine özgün primer-problar tasarlandı. Patojenlerin tüm genom dizileri veri bankalarından elde edildi ve genler seçilerek bu genlere ait diziler üzerinden patojen-spesifik primerler tasarlandı. Primer-prob tasarımı için Eurofinsgenomics'e ait in-siliko aracı kullanıldı. Elde edilen (GC oranı, Tm derecesi, hedeflenen amplikon uzunluğu) veriler BLAST ve Primer3 in-siliko yazılım araçları ile doğrulandı. Tasarlanan primer-prob dizilerinin başka bir virüs /bakteri genomu ile eşleşmediğini ve patojen-spesifik olduğu NCBI üzerinden bilinen tüm virüs/bakteri genomları ile karşılaştırılarak yapıldı. Primer-prob karakterizasyonları, optimizasyonları ve minimum tespit edilebilirlik (LOD) değerleri saptanarak testlerde kullanıldı. Aynı anda farklı patojenlere ait prob ışımalarının ölçülebilmesi için farklı florofor kanallar kullanıldı ve patojen-spesifik sigmoidal eğriler saptandı. Prob dizaynında, 5' ucunda florofor ve 3' ucunda söndürücü (quencher) olmak üzere farklı boyalar kullanılmıştır. Buna göre; ILT için Texas Red – BHQ1, AIV A/H5N1 için FAM – MGB, AIV A/H9N2 için HEX – MGB, AIV A/H7N9 için Texas Red – BHQ1, NDV için Cy-2 – BHQ2, E. coli ve E. coli O157:H7 için FAM – MGB, Salmonella spp. için HEX – MGB, P. multocida için Cy5 – BHQ2 kombinasyonları tercih edilmiştir. Buna karşılık, floresan sinyallerin izlendiği dedeksiyon kanalları şu şekilde belirlenmiştir: ILT için ROX kanalı, AIV alt tiplerinden A/H5N1 için FAM kanalı, A/H7N9 için ROX kanalı, A/H9N2 için HEX kanalı, NDV için Cy5 kanalı, E. coli ve E. coli O157:H7 için FAM kanalı, Salmonella spp. için HEX kanalı, P. multocida için ise Cy5 kanalı kullanılmıştır. Bulgular; patojen-spesifik primerler ile tüm etkenlerin saptanabildiğini gösterdi. Test ortamında aynı anda birden fazla etkenin genomu varlığında da tüm pozitif örneklerin başarıyla saptanabildiği ortaya konuldu. Kullanılan master mix ve primer-prob miktarları optimize edilerek birim test sarfiyatları azaltıldı ve minimize edilerek birim test maliyetleri yaklaşık %25 oranında düşürüldü. Çalışmalarda nükleik asit konsantrasyonu LOD miktarları değerlendirildi ve bu değerin P.multocida için 0,5 ng ve diğer tüm patojenler için 0,05 ng olduğu belirlendi. Sonuç olarak; ILT, NDV, AİV'ler (A/H5N1, A/H9N2, A/H7N9), E.coli, E.coli O157:H7, Salmonella spp. ve P. multocida nükleik asitlerinin aynı anda ve tek bir tanı kitiyle saptanabildiği ve ilgili patojenlerin neden oldukları hastalıkların aynı anda ve tek bir kit ile teşhis edilebilmesine olanak sağlayan bir Real-Time PCR tabanlı multiplex hızlı tanı paneli kiti geliştirildi.
Özet (Çeviri)
The rapid diagnosis of poultry diseases is important in terms of treatment, control, and biosecurity. In this thesis study, the aim was to develop a multiplex PCR-based diagnostic kit capable of detecting multiple pathogens simultaneously. The relevant pathogens were identified as Infectious Laryngotracheitis (ILT – GaHV-1), Newcastle Disease Virus (NDV), Avian Influenza Virus subtypes (AIV's - A/H5N1, A/H9N2, A/H7N9), E. coli and E. coli O157:H7, Salmonella spp., and Pasteurella multocida, and specific primer-probe sets were designed for each. The complete genome sequences of the pathogens were obtained from databases, and genes were selected to design pathogen-specific primers based on these sequences. The Eurofins Genomics in-silico tool was used for primer-probe design. The obtained data (GC content, Tm values, and targeted amplicon length) were verified using BLAST and Primer3 in-silico software tools. The designed primer-probe sequences were compared with all known viral and bacterial genomes in the NCBI database to ensure specificity and that they did not match any other viral or bacterial genomes. Primer-probe characterizations, optimizations, and minimum detection limits (LOD) were determined and used in the tests. To measure probe emissions for different pathogens simultaneously, different fluorophore channels were used, and pathogen-specific sigmoidal curves were obtained. In the probe design, different dyes were used with a fluorophore at the 5' end and a quencher at the 3' end. The following combinations were preferred: Texas Red – BHQ1 for ILT, FAM – MGB for AIV A/H5N1, HEX – MGB for AIV A/H9N2, Texas Red – BHQ1 for AIV A/H7N2, Cy-2 – BHQ2 for NDV, FAM – MGB for E. coli and E. coli O157:H7, HEX – MGB for Salmonella spp., and Cy5 – BHQ2 for P. multocida. In contrast, the detection channels used to monitor the fluorescent signals were as follows: ROX channel for ILT, FAM channel for AIV subtype A/H5N1, ROX channel for A/H7N2, HEX channel for A/H9N2, Cy5 channel for NDV, FAM channel for E. coli and E. coli O157:H7, HEX channel for Salmonella spp., and Cy5 channel for P. multocida. The findings indicated that all agents could be detected using pathogen-specific primers. It was also demonstrated that all positive samples could be successfully identified even in the presence of multiple pathogen genomes in the test environment. By optimizing the amounts of master mix and primer-probe used, the per-test reagent consumption was reduced, lowering the per-test cost by approximately 25%. In the study, the LOD values based on nucleic acid concentration were evaluated, and it was determined that this value was 0.5 ng for P. multocida and 0.05 ng for all other pathogens. In conclusion, a real-time PCR-based multiplex rapid diagnostic panel kit was developed that enables the simultaneous detection of ILT (GaHV-1), NDV, AIV's (A/H5N1, A/H9N2, A/H7N9), E. coli and E. coli O157:H7, Salmonella spp., and P. multocida nucleic acids, allowing the concurrent diagnosis of the diseases caused by these pathogens with a single diagnostic kit.
Benzer Tezler
- Ankara ilindeki yumurta tavukçuluğu işletmelerinde Dermanyssus gallinae'nin kümes içi dinamiği ve diğer akar popülasyonları ile arasındaki olası ilişkinin belirlenmesi
Determining the dynamics of Dermanyssus gallinae and its relationships between other mite populations in laying hen farm
NAFİYE KOÇ
Doktora
Türkçe
2019
ParazitolojiAnkara ÜniversitesiParazitoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞE SERPİL NALBANTOĞLU
- Erken Hristiyan ve ilk Bizans resim ve kabartma sanatında kaynak ve okullar (2 cilt)
Sources and school of painting and sculpture during the early Christian and first Byzantine period
AHMET MEHMET KİPMEN
- Broiler Coccidiosis'inde risk faktörlerinin lojistik regresyon analizi ile belirlenmesi
Quantifying risk factors of Coccidiosis in broilers using logistic regression analysis
AYTAÇ AKÇAY
Doktora
Türkçe
2009
BiyoistatistikAnkara ÜniversitesiBiyoistatistik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. OKAN ERTUĞRUL
- Elazığ ve Kocaeli illerinde kedi ve köpeklerde görülen kulak hastalıklarının prevalansı
The prevalance of ear diseases in cat and dogs in Elazıg and Kocaeli provinces
SELÇUK BAŞER
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Veteriner HekimliğiFırat ÜniversitesiCerrahi (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İBRAHİM CANPOLAT
- Kanatlı hayvanlarda aşı adayı escherichia coli mutant suşunun geliştirilmesi
Development of vaccine candidate escherichia coli mutant strain in poultry
TUĞÇE ÜSTÜN