Faj K'nın yapısal karakterizasyonu ile proteomik yaklaşım geliştirilmesi
Developing a proteomic approach through structural characterization of phage K
- Tez No: 942983
- Danışmanlar: PROF. DR. TÜLİN ÖZBEK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 147
Özet
Fajlar; konakçı bakterisine spesifik, gelişme ve çoğalma için konakçı metabolik faaliyetlerine ihtiyaç duyan, nispeten küçük genomlara sahip virüslerdir. Antibakteriyel tedaviler, aşılar ve gen aktarımı araçları olarak biyoteknolojik öneme sahip olan fajlar, son yıllarda birçok alanda kullanılmaya başlanmıştır. Ancak özellikle biyoteknolojik kullanım potansiyelinin farklı alanlarda geliştirilmesi için fajların kimliğinin, heterojenliğinin, safsızlık içeriğinin; hızlı ve daha spesifik olan analitik yöntemlerle tayini önem arz etmektedir. Bu tez çalışması kapsamında; bikinkoninik asit (BCA) yöntemi ile protein tayini, kapiler izoelektrik odaklama (cIEF), anyon değişim kromatografisi (AEX) ve SDS-PAGE teknikleri ile yapısal analizler gerçekleştirilmiş; ayrıca yüksek çözünürlüklü QTOF kütle spektrometrisi kullanılarak yapılan peptit haritalama analizleri ile faj karakterizasyonu detaylı şekilde ortaya konmuştur. Bu amaçla; S. aureus'a spesifik, litik yaşam döngüsüne sahip, genomunun bir kuyruğa bağlı kapsit içinde kapsüllendiği, çift sarmallı DNA (dsDNA)'lı kuyruklu bir faj olan Bakteriyofaj K kullanılmıştır. Tez çalışması kapsamında, BCA ile faj lizatının protein konsantrasyonu net olarak belirlendikten sonra pH gradiyenti esaslı cIEF analizi ile amfoterik özellikteki Faj K'a ait proteinlerin yapısal farklılıkları belirlenmiştir. Bu analizde; dsDNA içeren/içermeyen dolu ve boş kapsit yapısı, majör kuyruk kılıfı, kuyruk merkezi ucu ve taban plakası proteinlerinin yakın göç zamanları sergilediği tespit edilmiş olup Faj K'nın morfolojik yapısında bunların bitişik unsurlar olarak yer alması sonuçlarımızı doğrular niteliktedir. Tuz gradiyenti kullanılarak optimize edilen AEX metodu ile Faj K'nın saflaştırılması sağlanmış, safsızlık profili değerlendirilmiş ve dolu kapsid yapılarının toplam partikül içeriğine oranı nicel olarak belirlenmiştir. SDS-PAGE analizi aracılığıyla Faj K'ya ait protein profili elde edilerek protein bileşiminin heterojenliği ve kimliği görsel olarak analiz edilmiş; bu bulgular kapiler izoelektrik odaklama (cIEF) sonuçları ile karşılaştırılarak yapısal korelasyon ortaya konmuştur. Ardından gerçekleştirilen peptit haritalama analizi ile Faj K içeren lizattaki protein profili detaylı şekilde belirlenmiş ve tanımlanan proteinler yüksek güvenilirlik düzeyinde sınıflandırılmıştır. Bu proteinlerin, SDS-PAGE analizinde gözlemlenen bant profilleri ile örtüştüğü tespit edilmiş; böylece faj lizatındaki yüksek konsantrasyonlarının olası nedeni açıklığa kavuşturulmuştur. Ayrıca, peptit analizi aracılığıyla bu proteinlere ait translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler) tanımlanmış ve bu modifikasyonların Faj K protein yapısı üzerindeki potansiyel etkileri değerlendirilmiştir. Tez çalışması sonucunda, bir faj lizatının cIEF, AEX ve QTOF-MS esaslı peptit haritalama analizleri ile nasıl değerlendirilebileceği, gerekli optimizasyon ve standardizasyonlar nasıl sağlanacağı belirlenmiş olup faj karakterizasyonlarının fizikokimyasal analiz ile aydınlatılmasının önü açılmıştır. Elde edilen veriler ile NCBI gen bankında yer alan Faj K'ya ait genom esaslı protein verileri karşılaştırılarak benzerlik ve farklılıklar tespit edilmiş olup bu farklılıkların ana kaynağının PTM'lerin varlığı olduğu gözlenmiştir. Nitekim, PTM'lerin; proteinlerin üç boyutlu yapısını, fonksiyonunu, yük durumunu, kütle değişimini beraberinde getirdiği bilindiğinden biyoteknolojik öneme sahip proteinlerin üretiminde bunların dikkate alınması gerekliliği vurgulanmıştır.
Özet (Çeviri)
Phages are host bacteria-specific with relatively small genomes that require host metabolic activities for growth and replication. Phages, which have biotechnological importance as antibacterial treatments, vaccines and gene transfer tools, have been used in many fields in recent years. However, it is important to determine the identity, heterogeneity and impurity content of phages by fast and more specific analytical methods, especially for the development of biotechnological usage potential in different fields. Within the scope of this thesis, structural analyses were performed using protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay, capillary isoelectric focusing (cIEF), anion exchange chromatography (AEX), and SDS-PAGE. Furthermore, detailed phage characterization was conducted through peptide mapping analyses based on high-resolution QTOF mass spectrometry. For this purpose; Bacteriophage K, a tailed phage with double-stranded DNA (dsDNA), which is specific for S. aureus, has a lytic life cycle, its genome is encapsulated in a tail-associated capsid, was used. Within the scope of the thesis study, after the protein concentration of the phage lysate was clearly determined by BCA, the structural differences of the proteins of the amphoteric phage K were determined by pH gradient based cIEF analysis. In this analysis; full and empty capsid structure with/without dsDNA, major tail sheath, tail centre spike and baseplate proteins were found to exhibit close migration times and their presence as adjacent component in the morphological structure of Phage K confirms our results. Using the AEX method optimized with a salt gradient, Phage K was purified, its impurity profile was assessed, and the percentage of full capsid structures within the total particle content was quantitatively determined. The protein profile of Phage K was obtained via SDS-PAGE analysis, allowing visualization of protein heterogeneity and identity, which was further correlated with capillary isoelectric focusing (cIEF) results to confirm structural consistency. Subsequently, peptide mapping analysis was conducted to comprehensively identify the protein profile within the Phage K-containing lysate, and the detected proteins were classified as high-confidence and reliable identifications. These proteins showed strong concordance with the band patterns observed in SDS-PAGE, elucidating the reason behind their high concentrations in the lysate. Furthermore, post-translational modifications (PTMs) associated with these proteins were identified through peptide analysis, and the potential impact of these modifications on Phage K protein structures was evaluated. As a result of the thesis study, it has been determined how a phage lysate can be evaluated by cIEF, AEX and QTOF-MS based peptide mapping analyses, how to provide the necessary optimisation and standardisation, and opened the way for the elucidation of phage characterisation by instrumental analysis. By comparing the obtained data with the genome-based protein data of Phage K in the NCBI data bank, similarities and differences were determined and it was observed that the main source of these differences was the presence of PTMs. As a matter of fact, since PTMs are known to bring along the three-dimensional structure, function, charge state and mass change of proteins, it was emphasised that these should be taken into account in the production of proteins of biotechnological importance.
Benzer Tezler
- Characterization and genomic analysis of a novel bacteriophage against methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Methisilin dirençli Staphylococcus aureusa karşı yeni bakteriyofaj karakterizasyonu ve genomik tanımlanması
MEDİNE ÇOTAK
Doktora
İngilizce
2019
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MAHİNUR AKKAYA
PROF. DR. ZEYNEP CEREN KARAHAN
- Characterization of local Salmonella enteritidis isolates of chicken, egg and human origin
İnsan, tavuk ve yumurta kökenli lokal Salmonella enteritidis izolatlarının karakterizasyonu
BÜLENT İÇGEN
Doktora
İngilizce
2000
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CANDAN GÜRAKAN
PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
- KPF-6 olarak isimlendirdiğimiz klebsiella pneumoniae'ye etkili bakteriyofajımızın kan kültürlerinde üreyen klebsiella türleri üzerine etkinliğinin araştırılması
Investigation of the effectiveness of our klebsiella pneumoniae- effective bacteriophage, which we named KPF-6, on klebsiella species grown in blood cultures
NAZRIN ABIZADE
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATMA KÖKSAL ÇAKIRLAR
- Salmonella spp. ve Escherichia coli'ye etkili bakteriyofajların karakterizasyonu ve gıda uygulamaları
Characterization and food application of phages effective against Salmonella spp. and Escherichia coli
ESRA EKİZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI