Geri Dön

BMAL1'in BHLH ve PAS-A bölgelerinde yer alan patojenik SNP'lerinin BMA1 fonksiyonuna etkilerinin incelenmesi

Analyzing the effect of pathogenic SNPs found on the BHLH and pas-a domain of BMAL1

PDF İndir

  1. Tez No: 958163
  2. Yazar: HURSİMA İZGİŞ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MAHMUT ÇALIŞKAN, DOÇ. DR. ŞEREF GÜL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 60

Özet

Sirkadiyen (biyolojik) saat, organizmaların fizyolojisi ve davranışlarında yaklaşık yirmi dört saatlik (sirkadiyen) ritimler oluşturur ve bu ritimleri çevresel döngü ve diğer faktörlere göre düzenler. Sirkadiyen saat, memelilerin fizyolojik, biyokimyasal ve davranışsal birçok biyolojik işlevini kontrol eder. Bunlar, uyku düzeni, metabolizma, vücut sıcaklığı, hormon salınımı, detoksifikasyon, üreme, DNA onarımı ve apoptozdur. Böylece saat sistemi, yaşam ve sağlık kalitesinin sürekliliği için kritik bir kontrol mekanizmasıdır. Kanser, depresyon, obezite ve metabolik rahatsızlıklar gibi birçok hastalık, senkronizasyonu bozulmuş veya iyi çalışmayan saat mekanizmalarıyla bağlantılıdır. Memelilerde saat mekanizmasını düzenleyen 4 ana protein vardır: BMAL1, CLOCK (NPAS), CRY1 (CRY2) ve PER2 (PER1, PER3). BMAL1:CLOCK ikilisi transkripsiyon faktörü özelliğine sahiptir ve genlerin promotör bölgesindeki E-kutucuğuna bağlanarak dimer oluşturarak hücrelerdeki mRNA sentezinin yaklaşık %40'ını kontrol eder. Oluşan BMAL1:CLOCK kompleksi, CRY ve PER proteinlerinin sitoplazmaya salınımını sağlar. CRY ve PER çekirdeğe girdikten sonra BMAL1:CLOCK aktivitesini baskılar. Kısaca BMAL1, CLOCK, CRY ve PER, saat mekanizmasını kontrol eder. Tek nükleotit değişimleri (SNPler), bir gendeki tek bir bazın değişmesini ifade eden mutasyonlardır. Bazı SNPler, amino asitlerde yanlış anlamlı bir değişiklik yapar. Saat genlerinin amino asidini değiştiren bazı SNPler çeşitli hastalıklarla bağlantılıdır. Ailevi ileri evre uyku sendromu (FASPS) ile CRY2 ve PER2 geninde bulunan SNPler, PER1 ve PER3 gen polimorfizmleri ise ileri uyku fazı hastalığı ile bağlantılıdır. Sonuç olarak, saat genlerindeki SNP'lerin saat mekanizmasına etkisinin anlaşılması, sirkadiyen saat-hastalık ilişkisini ve hastalıkların moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Bu çalışmada, BMAL1 genindeki farklı SNP'lerin saat mekanizmasına olan etkisi incelendi. Saat mekanizmasında CRY1 ve CRY2 birbirinin paraloğu PER2 ile de PER1 ve PER3 birbirinin paraloğu iken BMAL1 için bir paralog bulunmamaktadır. Bu yüzden BMAL1 fonksiyonel olmadığında saat işleyişi bozulacaktır. Ensembl veri kayıtlarında BMAL11 genine ait 3000 yanlış anlamlı SNP listelenmiştir. İn siliko analizler sonucunda patojenik veya zarar verici olarak tahmin edilen ve BMAL1'in N-ucunda bulunan 6-SNP deneysel analizler için belirlendi (Gly41Arg, Ala154Val, Gly166Gln, Gly216Gln, Gly218Trp, Gly238Gln). Bu tez çalışması kapsamında 6 adet SNP (tek nokta mutasyonu içeren), yönlendirilmiş nokta mutasyon metodu ile Bmal1 cDNA'sı içeren plazmitlerde oluşturulmuştur. Mutasyonu varlığı illümina sekanslama ile doğrulanmıştır. Daha sonra bu 6 SNP'nin sirkadiyen saatin mekanizmasının pozitif döngüsündeki BMAL1:CLOCK transaktivasyonuna olan etkisi ve CYR1'e bağlı sirkadiyen saatin negatif döngüsündeki BMAL1:CLOCK transaktivasyon baskılanmasına etkisi raportör lüsiferaz deneyleri ile belirlenmiştir. Tüm BMAL1 SNPlerinin protein ifade seviyeleri western blot yöntemi ile incelenmiştir. SNPlerin proteinin kararlılığına etkisi sikloheksimid (CHX) tahlil deneyi ile yapılmış ve proteinin yıkım kinetiği belirlenmiştir. Ardından transaktivasyon ve baskılama deneylerinde anlamlı etki gösteren SNPlerin BMAL1ve CLOCK proteinlerinin birbiri ile olan etkileşimlerine etkisi birlikte-çöktürme deneyi ile belirlenmiştir.

Özet (Çeviri)

The circadian (biological) clock generates approximately 24-hour (circadian) rhythms in the physiology and behavior of organisms and adjusts these rhythms according to environmental cycles and other factors. The circadian clock regulates many physiological, biochemical, and behavioral functions in mammals. These include sleep patterns, metabolism, body temperature, hormone secretion, detoxification, reproduction, DNA repair, and apoptosis. Thus, the clock system serves as a critical regulatory mechanism for maintaining quality of life and health. Many diseases—such as cancer, depression, obesity, and metabolic disorders—are associated with malfunctioning or desynchronized clock mechanisms. In mammals, there are four main proteins that regulate the clock mechanism: BMAL1, CLOCK (or NPAS), CRY1 (CRY2), and PER2 (PER1, PER3). The BMAL1:CLOCK pair functions as a transcription factor and forms a dimer by binding to E-box elements in the promoter regions of genes, thereby controlling approximately 40% of mRNA synthesis in cells. The resulting BMAL1:CLOCK complex facilitates the expression and cytoplasmic release of CRY and PER proteins. Once CRY and PER enter the nucleus, they inhibit BMAL1:CLOCK activity. In short, BMAL1, CLOCK, CRY, and PER collectively control the clock mechanism. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are mutations that involve the change of a single base in a gene. Some SNPs result in missense mutations that alter amino acids. Certain SNPs that change amino acids in clock genes are associated with various diseases. For example, SNPs in the CRY2 and PER2 genes are linked to Familial Advanced Sleep Phase Syndrome (FASPS), while polymorphisms in the PER1 and PER3 genes are associated with advanced sleep phase disorder. In conclusion, understanding the effects of SNPs in clock genes on the circadian mechanism can help us better comprehend the relationship between the circadian clock and diseases, as well as the molecular mechanisms underlying these conditions. In this study, the effects of various SNPs in the BMAL1 gene on the circadian clock mechanism were investigated. While CRY1 and CRY2 are paralogs of each other in the clock mechanism, and PER2 is a paralog of PER1 and PER3, there is no known paralog for BMAL1. Therefore, if BMAL1 becomes nonfunctional, the operation of the circadian clock is disrupted. Ensembl database records list around 3,000 missense SNPs for the BMAL1 gene. Based on in silico analyses, six SNPs located in the N-terminus of BMAL1, predicted to be pathogenic or damaging, were selected for experimental analysis (Gly41Arg, Ala154Val, Gly166Gln, Gly216Gln, Gly218Trp, Gly238Gln). As part of this thesis work, six SNPs (each containing a single point mutation) were introduced into plasmids carrying Bmal1 cDNA using a site-directed mutagenesis method. The presence of mutations was confirmed by Illumina sequencing. Next, the effect of these six SNPs on BMAL1:CLOCK transactivation in the positive loop of the circadian mechanism and their impact on CRY1-dependent suppression of BMAL1:CLOCK transactivation in the negative loop were evaluated using luciferase reporter assays. The protein expression levels of all BMAL1 SNPs were examined via Western blotting. The effects of SNPs on protein stability were assessed using a cycloheximide (CHX) chase assay, and the degradation kinetics of the proteins were determined. Finally, for those SNPs that showed significant effects in transactivation and suppression assays, the influence on BMAL1–CLOCK protein–protein interactions was evaluated using co-immunoprecipitation assays.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    397221

    Investigation of the interaction between mouse cryptochrome-1 and leptin receptor overlapping Transcript Like-1

    Fare leptin receptor overlapping transcript Like-1 (Leprotl1) ve Cryptochrome 1 (Cry1) proteinleri arasındaki etkileşimin incelenmesi

    DERYA KABACAOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyokimyaKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. İBRAHİM HALİL KAVAKLI

  2. Tez No

    414068

    Molecular analyses of the effects of clock gene SNPs on the biological clock

    Biyolojik saat genlerinde bulunan SNPlerin biyolojik saat üzerine etkilerinin moleküler düzeyde incelenmesi

    BERKE GÜRKAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    GenetikKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. İBRAHİM HALİL KAVAKLI

    YRD. DOÇ. FUNDA ŞAR

    DOÇ. NURİ ÖZTÜRK

  3. Tez No

    944952

    Bmal1'in PAS-B alanı ve C-ucu osilasyon regülatör bölgelerinde yer alan patojenik snp'lerinin bmal1 fonksiyonuna etkilerinin incelenmesi

    Analyzing the effect of pathogenic SNPs found on the PAS-B and C-terminal oscillator regulatory domains of bmal1

    SELAHATTİN AYDOĞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    Biyoteknolojiİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MAHMUT ÇALIŞKAN

    DOÇ. DR. ŞEREF GÜL

  4. Tez No

    741071

    BMAL1'in akut ve subakut dönem travmatik beyin hasarında rolünün incelenmesi

    Investigation of the role of BMAL1 in acute and subacute period traumatic brain injury

    ELİF SERTEL EVREN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Biyolojiİstanbul Medipol Üniversitesi

    Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERTUĞRUL KILIÇ

  5. Tez No

    661036

    BMAL1'in beyin hasarı sonrası rolünün proteomik açıdan incelenmesi

    Investigation of the role of BMAL1 following brain injury using proteomic approaches

    ELİF ÖZBAY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Medipol Üniversitesi

    Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA ÇAĞLAR BEKER

Geri Dön