Glioblastoma hücre hattında Hsc70 geninin CRISPR/Cas9 teknolojisi ile susturulması
Silencing of the Hsc70 Gene by CRISPR/Cas9 technology in a glioblastoma cell line
- Tez No: 961512
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ DENİZ SÜNNETÇİ AKKOYUNLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Glioblastoma Multiforme, Hsc70, CRISPR/Cas9, U87-MG
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 81
Özet
Glioblastoma Hücre Hattında Hsc70 Geninin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Susturulması Amaç: Glioblastoma Multiforme (GBM), santral sinir sisteminin en sık görülen malin tümörüdür. Bu yüksek proliferatif ve invaziv özellikler, klasik tedavi yöntemlerinin etkinliğini sınırlandırmakta ve tedaviye direnç gelişimini kolaylaştırmaktadır. Bu nedenle GBM'ye özgü moleküler mekanizmaların anlaşılması ve hedeflenebilir biyobelirteçlerin tanımlanması büyük önem arz etmektedir. Hsc70 geni, kanser hücrelerinde anormal derecede yüksek ekspresyon göstermekte olup, bu özelliği onu potansiyel bir terapötik hedef haline getirmektedir. Bu çalışmada, hücresel stres yanıtlarında ve protein homeostazında kilit rol oynayan bir moleküler şaperon olan Hsc70 geninin U87-MG glioblastoma hücre hattında CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak susturulmasının fenotipik ve moleküler etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Yöntem: Çalışmada Hsc70 geni üzerinde hedef bölgeye özgü iki farklı sgRNA dizisi tasarlanarak in-vitro transkripsiyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Plazmid vektörü kullanarak klonlama çalışmaları yapılmış ve katyonik polimer sistemi ile transfeksiyon gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyon sonrası GFP+ hücreler Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) yöntemi ile izole edilmiş, bu hücreler üzerinden mutasyon saptama analizleri ve Hsc70 geni manipülasyonun hücre döngüsüne etkisini görmek için hücre döngüsü kontrol genlerine Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real Time PCR) ile gen ifade analizleri yapılmıştır. Bulgular: U87-MG hücre hattında CRISPR/Cas9 ile gerçekleştirilen manipülasyon, mutasyon saptama analizleri ile tespit edilmiştir. Elde edilen mutasyonlu hücrelerden yapılan Gerçek Zamanlı PZR analizleri sonucunda Hsc70 geninin ifadesinin azaldığı tespit edilmiştir. Hücre döngüsü kontrol genlerinden CDK1 ve Siklin D1 genlerinde ekspresyonun azaldığı, p53 ve p21 genlerinde ekspresyonun arttığı tespit edilmiştir. Sonuç: Hsc70 geninin susturulması hem proliferatif sinyallemenin bastırılmasına hem de apoptozu indükleyen tümör baskılayıcı yolakların aktive olmasına yol açmaktadır. CRISPR Cas9 teknolojisinin glioblastoma gibi tedaviye dirençli kanser tiplerinde genetik hedefleme yoluyla yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesinde nasıl etkili ve hassas bir yöntem olabileceğini göstermektedir. Hsc70 geninin bu teknoloji aracılığıyla baskılanmasıyla elde edilen sonuçlar, Glioblastomanın prognozunu iyileştirmek ve yeni tedavi stratejileri önemli çıkarımlar sunmaktadır.
Özet (Çeviri)
Silencing of the Hsc70 Gene by CRISPR/Cas9 Technology in a Glioblastoma Cell Line Objective: Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant tumor of the central nervous system. Its highly proliferative and invasive nature limits the effectiveness of conventional treatment methods and facilitates the development of therapy resistance. Therefore, understanding GBM-specific molecular mechanisms and identifying targetable biomarkers are of great importance. The Hsc70 gene, which is abnormally overexpressed in cancer cells, represents a potential therapeutic target due to this characteristic. This study aimed to investigate the phenotypic and molecular effects of silencing the Hsc70 gene a molecular chaperone that plays a crucial role in cellular stress responses and protein homeostasis using CRISPR-Cas9 technology in the U87-MG Glioblastoma cell line. Methods: Two different sgRNA sequences specific to the target region of the Hsc70 gene were designed, and in vitro transcription experiments were conducted. Cloning studies were performed using a plasmid vector, and transfection was carried out using a cationic polymer system. After transfection, GFP+ cells were isolated by FACS, and mutation detection analyses and gene expression analyses were performed using Real-Time PCR on these cells. Results: Manipulation via CRISPR-Cas9 in the U87-MG cell line was confirmed through mutation detection analyses. Real-Time PCR results from the mutated cells revealed decreased expression of Hsc70, CDK1, and Cyclin D1 genes, while p53 and p21 gene expressions were found to be increased. Conclusion: Silencing the Hsc70 gene leads to both suppression of proliferative signaling and activation of tumor-suppressive pathways that induce apoptosis. This study demonstrates how CRISPR-Cas9 technology can be an effective and precise method for developing novel therapeutic strategies through genetic targeting in treatment-resistant cancers such as glioblastoma. The results obtained by silencing the Hsc70 gene via this technology offer significant insights for improving the prognosis of glioblastoma and developing new therapeutic approaches.
Benzer Tezler
- EdU molekülünün şaperon aracılı otofajideki rolü
The role of the EdU molecule in chaperone-mediated autophagy
CEREN GENCEL GÜLER
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
- Glioma hücrelerinde rosmarinik asitin antikanser moleküler mekanizmalarının araştırılması
Investigation of anticancer molecular mechanisms of rosmarinic acid in glioma cells
ASLIHAN ŞENGELEN
Doktora
Türkçe
2023
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
- Anti kanser ilaç direnç mekanizmasında ısı şoku proteinlerinin şaperon aktivitesinin araştırılması
Investigation of chaperone activity of heat shock proteins in anti-cancer drug resistance mechanism
DUDU MELEK GÜRSOY
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MURAT PEKMEZ
- Timolün glioblastoma hücre hattında Aβ25-35 ile oluşturulan Alzheimer modeli üzerindeki nöroprotektif etkisinin araştırılması
Investigation of the neuroprotective potential of thymol on an Alzheimer's model created with Aβ25-35 in glioblastoma cell line
BESTE BALBAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Tıbbi BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEFA KIZILDAĞ
- Cerulenin uygulanmış U87 glioblastoma hücre hattında endoplazmik retikulum stresinin araştırılması
Investigation of endoplasmic reticulum stress in cerulenin treated U87 glioblastoma cell line
ŞEFİKA BEYZA METE
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Biyokimyaİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MURAT PEKMEZ