Characterization of chemical and genetic regulators of human naive pluripotent stem cells
İnsan naif pluripotent kök hücrelerinin kimyasal ve genetik düzenleyicilerinin karakterizasyonu
- Tez No: 967192
- Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Tıbbi Biyoloji, Genetics, Molecular Medicine, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Pluripotent kök hücreler, naif ve primed olmak üzere iki temel gelişimsel durumda bulunur. Naif pluripotent kök hücreler, daha geniş gelişimsel potansiyelleri nedeniyle erken embriyonik gelişimin modellenmesi açısından özel bir vaat taşımaktadır. Ancak, insan naif pluripotent kök hücrelerinin türetilmesi ve stabil olarak sürdürülmesi teknik açıdan halen zorludur. Bu tez, primed durumdan naif duruma geçişi kısıtlayan epigenetik mekanizmaları ortaya çıkarmayı ve dönüşüm verimliliğini artıracak stratejiler geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu kapsamda, birkaç kromatin düzenleyici faktörün (DOT1L, P300/CBP, MENIN ve BRD9) naif dönüşüm üzerindeki etkileri küçük molekül inhibitörleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Naif dönüşümü izlemek için iki bağımsız reporter sistemi kullanılmıştır: biri OCT4'ün farklılaştırılmış enhancer kullanımına, diğeri ise KLF17 ekspresyonuna dayalıdır. İnhibitör uygulamaları, yakın zamanda geliştirilen bir kültür koşulu (HENSM) altında gerçekleştirilmiştir. Dönüşüm verimliliği, floresan marker ekspresyonu için akış sitometrisi ve naif-spesifik genler için RT-qPCR kullanılarak nicel olarak değerlendirilmiştir. Bulgular, DOT1L inhibitörü EPZ5676 ve MENIN inhibitörü VTP50469'un naif dönüşüm üzerindeki epigenetik engelleri anlamlı düzeyde azalttığını göstermektedir. Buna karşılık, P300/CBP ve BRD9'u hedefleyen inhibitörler daha sınırlı etkiler ortaya koymuştur. RT-qPCR sonuçları, DPPA3, TFCP2L1 ve KLF17 gibi naif markerların yukarı regülasyonunu ve primed ya da soy ile ilişkili genlerin aşağı regülasyonunu doğrulamıştır. Bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, DOT1L ve MENIN'in insan kök hücrelerinde naif pluripotensinin önünde önemli epigenetik bariyerler olarak işlev gördüğü anlaşılmaktadır. Ayrıca, bu laboratuvarda oluşturulan yeni bir KLF17-GFP reporter hattı fonksiyonel olarak karakterize edilmeye çalışılmış ve durum geçişlerini izlemeye yönelik naif-spesifik bir marker olarak potansiyeli değerlendirilmiştir. Tezin üçüncü bölümünde ise hem primed hem de naif iPSC'lerde gen silme çalışmalarını kolaylaştırmak amacıyla, AAVS1 güvenli bölgesine indüklenebilir Cas9 geninin entegre edildiği bir insan iPSC hattı genom düzenleme ile oluşturulmuştur. Genel olarak, bu çalışma, DOT1L ve MENIN gibi spesifik epigenetik düzenleyicilerin inhibe edilmesinin insan naif pluripotent kök hücrelerinin elde edilme verimliliğini önemli ölçüde artırabileceğini göstermektedir. Ayrıca, naif pluripotensinin düzenlenmesini incelemeye ve hem naif hem de primed koşullarda gen knockout çalışmalarına uygun yeni bir reporter sistemi ve genom düzenlenmiş bir iPSC hattı tanıtmaktadır.
Özet (Çeviri)
Pluripotent stem cells exist in two main developmental states, which are naive and primed. Naive pluripotent stem cells hold particular promise for modelling early embryonic development due to their broader developmental potential. However, the derivation and stable maintenance of human naive pluripotent stem cells remain technically challenging. This thesis aims to uncover the epigenetic mechanisms that restrict the transition from the primed to the naive state and to develop strategies that improve conversion efficiency. In particular, the effects of several chromatin modifying factors (DOT1L, P300/CBP, MENIN, and BRD9) on naive conversion were evaluated using small-molecule inhibitors. Two independent reporter systems (one based on differential enhancer usage of OCT4 and the other based on KLF17 expression) were employed to monitor naive conversion. Inhibitor treatments were conducted under a recently developed culture condition (HENSM). Conversion efficiency was assessed quantitatively using flow cytometry for fluorescent marker expression and RT-qPCR for naive-specific genes. The findings demonstrate that DOT1L inhibition using EPZ5676 and MENIN inhibition using VTP50469 significantly relieve epigenetic constraints on naive conversion. On the other hand, inhibitors targeting P300/CBP and BRD9 exhibited more limited effects. RT-qPCR results confirmed the upregulation of naive markers such as DPPA3, TFCP2L1, and KLF17, and the downregulation of primed or lineage-related genes. Collectively, these results indicate that DOT1L and MENIN function as key epigenetic barriers to naive pluripotency in human stem cells. In addition, a novel KLF17-GFP reporter line, generated in this laboratory, was functionally characterized in this thesis to validate its utility as a naive-specific marker for monitoring state transitions. In the third part of the thesis, to facilitate gene knockouts in both primed and naive iPSCs, I generated a human iPSC line carrying an inducible Cas9 gene at the AAVS1 safe harbour locus via genome editing. Overall, this study shows that inhibiting specific epigenetic regulators like DOT1L and MENIN can greatly improve the efficiency of generating human naive pluripotent stem cells. It also introduces a novel reporter system and a genome-edited iPSC line that can be suitable for dissecting the regulation of naive pluripotency and for gene knockout studies in both naive and primed conditions.
Benzer Tezler
- Molecular dynamics simulations of chk2 kinase domain mutants
CHK2 kı̇naz domain mutantlarının moleküler dı̇namı̇k sı̇mülasyonları
EBRU TUNCAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MERT GÜR
- Production and characterization of siRNA loaded magnetic nanoparticles to be used in cancer treatment
Kanser tedavisinde kullanılmak üzere siRNA yüklü manyetik nanopartiküllerin üretimi ve karakterizasyonu
AMINA SELIMOVIC
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
- Bacillus subtilis GntR ailesine ait LutR transkripsiyon faktörünün doğrudan kontrolü altındaki genlerin CHIP ve EMSA yöntemleriyle belirlenmesi
Determination of genes under the direct control of GntR-type transcriptional factor LutR in Bacillus subtilis PY79 by CHIP and EMSA methods
MURAT KEMAL AVCI
Doktora
Türkçe
2015
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Mikrodalga uygulanan MIR604 ve MON810 mısır unlarının omik yaklaşım ile karakterizasyonu
Characterization of microwave-treated MIR604 and MON810 maize flours with omics approach
BEGÜM ZEYNEP HANÇERLİOĞULLARI
Doktora
Türkçe
2024
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. REMZİYE YILMAZ
- Characterization of the yvfI mutant spores
yvfI mutant sporlarının karakterizasyonu
EZGİ ARSLAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ