Infundibulicybe geotropa (bull.) harmaja ve Tricholoma scalpturatum (fr.) quél. mantar türlerinin sitotoksik ve timidin fosforilaz inhibisyon aktivitelerinin belirlenmesi, biyoaktif bileşiklerinin izolasyonu ve yapılarının aydınlatılması
Determination of cytotoxic and Thymidine phosphorylase inhibition activities, isolation of bioactive compounds and elucidation of their structures from the mushroom species Infundibulicybe geotropa (bull.) harmaja and Tricholoma scalpturatum (fr.) quél.
- Tez No: 968574
- Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 454
Özet
Mantarlar, bağışıklık sistemini düzenleyici ve antikanser etkili polisakkaritler ile triterpenoidler gibi biyoaktif bileşikler içermeleri nedeniyle günümüzde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Artan kanser vakaları ve ilaç direnci sorunları, mantarlardan elde edilebilecek yeni biyoaktif bileşiklerin keşfinin geliştirilmesine yönelik bilimsel ilgiyi giderek artırmaktadır. Bu çalışmada Ülkemizde doğal olarak yetişen yenilebilir Infundibulicybe geotropa (Bull.) Harmaja ve Tricholoma scalpturatum (Fr.) Quél. türlerinden biyoaktif maddelerin izolasyonu ve bu bileşiklerin yapılarının aydınlatılması amaçlanmıştır. Ekstrelerin ve saflaştırılan bileşiklerin kolon (CaCo-2), meme (MCF-7), akciğer (H1299) ve prostat (LnCap) kanser hücre hatlarında; sitotoksik aktiviteleri, böbrek (HEK293) sağlıklı hücre hatlarına karşı toksisiteleri, üç farklı yaklaşımla apoptoz analizleri ve timidin fosforilaz inhibisyon aktiviteleri yapıldı. Ankara'dan toplanan I. geotropa ve T. scalpturatum mantarları uygun koşullarda kurutulduktan sonra oda sıcaklığında gerçekleştirilen ekstraksiyon işlemleri, artan polariteye sahip çözücülerle (petrol eteri, aseton, metanol ve su); yapıldı. Sulu ekstraktlar etanol ile çöktürülerek HWEP (etanol ile çöken) ve HWES (etanolde çözünen) fraksiyonlarına ayrıldı. Ekstrelerin; sitotoksik aktiviteleri insan kolon (CaCo-2), meme (MCF-7), akciğer (H1299) ve prostat (LnCaP) kanser hücre hatları ile sağlıklı böbrek hücre hattı (HEK293) üzerinde MTT metodu ile incelendi. Apoptoz analizleri, Annexin-V/PI boyama ve gen/protein ekspresyon analizleriyle gerçekleştirildi. Ayrıca, ekstrelerin antioksidan; aktiviteleri (ABTS katyon radikali giderim, CUPRAC indirgeme kapasitesi, DPPH serbest radikali giderim ve β-karoten-linoleik asit, ), antikolinesteraz (asetilkolinesteraz/bütirilkolinesteraz) ve antidiyabetik (α-amilaz ve α-glukosidaz) aktiviteleri ile timidin fosforilaz (TP) inhibisyon aktiviteleri çalışıldı. Antioksidan aktiviteye ilişkin bulgulara göre özellikle iki mantar; türünün metanol ve aseton; ekstrelerinin orta düzeyde radikal giderimi ve indirgeme kapasitesi gösterdiği belirlendi. I. geotropa'nın metanol ekstresi, ABTS katyon radikali giderimi aktivitesinde (IC₅₀ =75.03 µg/mL) en iyi antioksidan etkiyi gösterdi. Enzim inhibisyon analizlerinde, timidin fosforilaz inhibisyonu açısından özellikle I. geotropa petrol eteri ekstresi (% inh = %74,9 inhibisyon) ve T. scalpturatum aseton ekstresi (% inh = %54,8 inhibisyon) yüksek aktivite gösterdi. Sitotoksik etki analizlerinde, hem T. scalpturatum hem de I. geotropa'nın petrol eteri ve aseton ekstreleri dört kanser hücre hattında farklı sitotoksik aktivite gösterdi. Özellikle T. scalpturatum'un aseton ekstresi Caco-2 hücre hattına karşı (EC₅₀ =46,86 µg/mL) en yüksek aktiviteyi sergiledi. Aynı şekilde, I. geotropa'nın petrol eteri ekstresi LnCap hücre hattında (EC₅₀ =63,19 µg/mL) kayda değer aktivite gösterdi. Mantar ekstreleri ve fraksiyonlarının HEK293 sağlıklı hücre hattına karşı toksik olmadığı belirlendi. Apoptoz analizleri üç farklı yaklaşımla incelendi. Annexin-V/propidyum iyodür (PI) boyama yöntemi ile yapılan analizlerde, seçilen mantar ekstrelerinin Caco-2 ve MCF-7 hücrelerinde apoptotik hücre oranında anlamlı bir artışa neden olduğu belirlendi. Gen ekspresyon analizlerinde pro-apoptotik genlerin (BAX, kaspaz 3, kaspaz 8, kaspaz 9) ekspresyon seviyelerinde artış, anti-apoptotik BCL-2 geninde ise azalma saptandı. Biyoaktif bileşenlerin izolasyonu sitotoksik aktivite sonuçlarına göre EC50 değeri hesaplanabilen I. geotropa ve T. scalpturatum mantarının aseton ekstreleri ile fraksiyonları kolon kromatografisi (Prep. Recycle-HPLC, preparatif ince tabaka gibi) ayırma yöntemleri kullanılarak; toplamda 36 madde saflaştırıldı ve yapıları NMR, GC-MS ve kütle spektrometrisi yöntemleriyle belirlendi. Spektroskopik analizlerin ardından elde edilen veriler, yapı benzerlikleri dikkate alınarak değerlendirildiğinde toplam 23 farklı bileşiğin tanımlandığı anlaşılmıştır. T. scalpturatum aseton ekstresinden, etil oleat (1, 2), (ergosta-7,24(28)-dien-3β-ol (3), ergesterol peroksit (4, 12, 17), N-(1,3,4-trihidroksikosan-2-il) dokosanamid (5), palmitik asit, oleik asit karışımı (6), oleik asit (7), 3β-hidroksi ergosterol-5-en (8), ergosta-5,22-dien 3β-ol (9, 10), ergosta-5,22-dien-il-tetradekanoat (11), 3,4-dihidroksi benzaldehit (13), 4-(3,4-dihidroksifenil)-3-büten-2-on (14, 15), trans sinnamik asit (16), palmitik asit (18), serevisterol (19), 5α,9α-epoksiergosta-7,22-dien-3β,6β-diol (20), N-[3-hidroksi, 9-metil-1-glukopiranozil, aykosa-4,8-dienil]-2-hidroksi hekzadesenamit (21), I. geotropa aseton ekstresinden, ergesterol peroksit (22, 23, 33), ergosta-5,22-dien-il-monokosanoat (24), ergosta-5,22-dien-il-oktanat (25), ergosta-4,6,8(14)-22-tetraen-3-on (26, 27), ergosta-5,22-dien 3β-ol (28), urasil (29), oleik asit (30, 31), miristik asit (32), 2,3-dihidroksipropil-1-oleat (34), 5α,6α-epoksiergosta-7,22-dien-3β,6β-diol (35), serevisterol (36) elde edilen maddelerdir. Spektroskopik yöntemlerle yapısal tanımlamaları yapılan bileşiklerin sitotoksik aktiviteleri, tez kapsamında kullanılan kanser hücre hatları üzerinde uygulanan in vitro biyolojik testlerle değerlendirildi.
Özet (Çeviri)
Mushrooms have become an important research area today due to their content of bioactive compounds, such as polysaccharides and triterpenoids, which have immunomodulatory and anticancer effects. Increasing cancer cases and drug resistance problems are gradually growing scientific interest in the development of new bioactive compounds from mushrooms. In this study, it was aimed to isolate bioactive compounds from the edible species Infundibulicybe geotropa (Bull.) Harmaja and Tricholoma scalpturatum (Fr.) Quél., which naturally grow in our country, and to elucidate the structures of these compounds. The cytotoxic activities of the extracts and purified compounds were tested on colon (CaCo-2), breast (MCF-7), lung (H1299), and prostate (LnCap) cancer cell lines; their toxicities against kidney (HEK293) healthy cell lines; apoptosis analyses with three different approaches; and thymidine phosphorylase inhibition activities were studied. The I. geotropa and T. scalpturatum mushrooms collected from Ankara were dried under appropriate conditions, and extraction processes at room temperature were carried out with solvents of increasing polarity (petroleum ether, acetone, methanol, and water). Aqueous extracts were precipitated with ethanol and separated into HWEP (precipitated with ethanol) and HWES (dissolved in ethanol) fractions. The cytotoxic activities of the extracts were examined by the MTT method on human colon (CaCo-2), breast (MCF-7), lung (H1299), and prostate (LnCaP) cancer cell lines and healthy kidney cell line (HEK293). Apoptosis analyses were performed with Annexin-V/PI staining and gene/protein expression analyses. In addition, the antioxidant activities (ABTS cation radical scavenging, CUPRAC reducing capacity, DPPH free radical scavenging, and β-carotene-linoleic acid), anticholinesterase (acetylcholinesterase/butyrylcholinesterase), antidiabetic (α-amylase and α-glucosidase) activities, and thymidine phosphorylase (TP) inhibition activities of the extracts were studied. According to the findings related to antioxidant activity, especially the methanol and acetone extracts of both mushroom species showed moderate radical scavenging and reducing capacity. The methanol extract of I. geotropa showed the best antioxidant effect in ABTS cation radical scavenging activity (IC50 = 75.03 µg/mL). In enzyme inhibition analyses, I. geotropa petroleum ether extract (% inh = 74.9% inhibition) and T. scalpturatum acetone extract (% inh = 54.8% inhibition) showed high activity in terms of thymidine phosphorylase inhibition. In cytotoxic effect analyses, both petroleum ether and acetone extracts of T. scalpturatum and I. geotropa showed different cytotoxic activities on four cancer cell lines. Especially, the acetone extract of T. scalpturatum exhibited the highest activity against the Caco-2 cell line (EC50 = 46.86 µg/mL). Similarly, the petroleum ether extract of I. geotropa showed significant activity in the LnCap cell line (EC50 = 63.19 µg/mL). It was determined that the mushroom extracts and fractions were not toxic to the HEK293 healthy cell line. Apoptosis analyses were examined with three different approaches. In the analyses performed by the Annexin-V/propidium iodide (PI) staining method, it was determined that the selected mushroom extracts caused a significant increase in the rate of apoptotic cells in Caco-2 and MCF-7 cells. In gene expression analyses, an increase in the expression levels of pro-apoptotic genes (BAX, caspase 3, caspase 8, caspase 9) and a decrease in the anti-apoptotic BCL-2 gene were detected. The isolation of bioactive components was carried out using acetone extracts and fractions of I. geotropa and T. scalpturatum mushrooms, for which EC₅₀ values could be calculated according to cytotoxic activity results, by using separation methods such as column chromatography (Prep. Recycle-HPLC, preparative thin layer chromatography); a total of 36 substances were purified and their structures were determined by NMR, GC-MS, and mass spectrometry methods. After spectroscopic analyses, it was understood that a total of 23 different compounds were identified based on structural similarities. From T. scalpturatum acetone extract, ethyl oleate (1, 2), ergosta-7,24(28)-dien-3β-ol (3), ergosterol peroxide (4, 12, 17), N-(1,3,4-trihydroxycosan-2-yl) docosanamide (5), palmitic acid and oleic acid mixture (6), oleic acid (7), 3β-hydroxy ergosterol-5-en (8), ergosta-5,22-dien 3β-ol (9, 10), ergosta-5,22-dienyl-tetradecanoate (11), 3,4-dihydroxy benzaldehyde (13), 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-buten-2-one (14, 15), trans cinnamic acid (16), palmitic acid (18), cerevisterol (19), 5α,9α-epoxyergosta-7,22-dien-3β,6β-diol (20), N-[3-hydroxy, 9-methyl-1-glucopyranosyl, eicosa-4,8-dienyl]-2-hydroxy hexadecenamide (21); from I. geotropa acetone extract, ergosterol peroxide (22, 23, 33), ergosta-5,22-dienyl-monocosanoate (24), ergosta-5,22-dienyl-octanoate (25), ergosta-4,6,8(14)-22-tetraen-3-one (26, 27), ergosta-5,22-dien 3β-ol (28), uracil (29), oleic acid (30, 31), myristic acid (32), 2,3-dihydroxypropyl-1-oleate (34), 5α,6α-epoxyergosta-7,22-dien-3β,6β-diol (35), cerevisterol (36) were obtained. The cytotoxic activities of the compounds structurally identified by spectroscopic methods were evaluated with in vitro biological tests applied to cancer cell lines used in the thesis.
Benzer Tezler
- Kestel bölgesinde (Kadınhanı-Konya) yaygın olarak yetişen bazı makromantarların antimikrobiyal aktivitelerinin araştırılması
Investigation of the antimicrobial activities of some macrofungus growing in the Kestel Region (Kadınhanı-Konya)
AYŞEGÜL YAPRAK
