Rekombinant faj tail proteinlerinin bakterilere adezyonundaki rollerinin araştırılması
Investigation of the role of recombinant phage tail proteins in adhesions to bacteria
- Tez No: 970838
- Danışmanlar: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji, Genetik, Biyoteknoloji, Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Genetics, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Bakteriyofajlar, DNA-rekombinant, ELISA, Enfeksiyon kontrolü, Bacteriophages, DNA-recombinant, Infection control
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Proteus mirabilis ve Proteus vulgaris, özellikle kateter ilişkili üriner sistem enfeksiyonları (CAUTI), piyelonefrit, sepsis ve taş oluşumu gibi ciddi klinik tablolarda rol alan önemli fırsatçı patojenlerdir. Bu bakterilerin sahip olduğu yüzey yapıları, biyofilm oluşturma kapasitesi ve artan antibiyotik direnci, enfeksiyonların tanı ve tedavisini güçleştirmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı, P. mirabilis RP6 ve P. vulgaris RP7 bakteriyofajlarından elde edilen reseptör bağlayıcı proteinler (RBP), Gp35 ve Gp106'nın rekombinant üretimi ve tanısal potansiyellerinin detaylı olarak değerlendirilmesidir. Çalışma, bu proteinlerin özgüllük, duyarlılık, bağlanma spektrumu, biyolojik örneklerdeki performansı, faj adsorpsiyonunu engelleme kapasitesi ve antibakteriyel/sitotoksik etkileri bakımından karakterize edilmesini hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Gp35 ve Gp106 proteinlerini kodlayan gen dizileri, spesifik primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiş ve elde edilen amplikonlar pET-30a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlama işlemi doğrulandıktan sonra, rekombinant proteinler Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilmiş ve Ni-NTA afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan RBP'lerin Proteus spp.'ye özgü bağlanma kapasiteleri kristal viyole boyama ve ELISA yöntemleriyle analiz edilmiştir. Farklı bakteri yoğunluklarıyla gerçekleştirilen C-ELISA deneyleri ile RBP'lerin tespit limitleri belirlenmiş, bağlanma spektrumları ise 49 klinik izolat ile test edilmiştir. Ayrıca, idrar gibi biyolojik ortamlarda bağlanma performansı test edilmiş ve rekombinant proteinlerin fajlar ile aynı reseptör bölgelerine bağlanıp bağlanmadığı rekabetçi adsopsiyon deneyleri ile ortaya konmuştur. Rekombinant proteinlerin antibakteriyel etkisi spot-test analizi ile, sitotoksisite ise insan fibroblast hücrelerinde WST-1 yöntemiyle belirlenmiştir. Bulgular: Gp35 ve Gp106 proteinleri yalnızca Proteus spp. izolatlarına bağlanmış, heterolog bakterilere (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) karşı sinyal üretmemiştir. C-ELISA tabanlı duyarlılık analizlerinde her iki protein de ≈10³ CFU/mL sınırında hedefe özgül bağlanma gösterebilmiştir. Bağlanma spektrumu analizinde Gp35'in Proteus izolatlarının %82,5'ine, Gp106'nın ise %90'ına bağlandığı saptanmış; bu durum Gp106'nın daha geniş bir konak aralığına sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bazı izolatlarda Gp35 ve Gp106 bağlanmasına rağmen ilgili fajların enfekte edememesi, RBP'lerin tanı platformlarında fajlara göre daha geniş spektrum sunabileceğini ortaya konmuştur. Biyolojik örneklerde yapılan testlerde RBP'ler, idrar ortamında özgüllüklerini koruyarak hedef bakterilere başarıyla bağlanmıştır. Rekabetçi faj adsorpsiyon testlerinde ise Gp35 ve Gp106'nın, RP6 ve RP7 fajlarının hedef hücrelere bağlanmasını %65–80 oranında engellediği belirlenmiştir. Bu sonuç, her iki proteinin de fajların bağlandığı özgül reseptörlere yöneldiğini ve bu reseptörleri işgal ederek faj enfeksiyonunu baskılayabildiğini göstermiştir. Son olarak, her iki RBP'nin de uygulandığı bakterilerde herhangi bir antibakteriyel etki gözlemlenmemiş, dolayısıyla yalnızca hedef tanıma ve bağlanma işlevi gördükleri belirlenmiştir. Ayrıca, bu iki rekombinant proteinin insan fibroblast (BJ) hücre hattı üzerinde de herhangi bir sitotoksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Sonuç: Bu tez çalışması, Proteus spp.'ye özgül rekombinant RBP'lerin ilk sistematik karakterizasyonunu sunmaktadır. Gp35 ve Gp106, tanı uygulamalarında kullanılmak üzere yüksek özgüllük, geniş spektrum, klinik örnek uyumluluğu ve hedef reseptör doğruluğu gibi özellikleri bir arada taşıyan adaylardır. Antibakteriyel veya sitotoksik etkiler göstermemeleri sayesinde, canlı hücre tespiti gereken uygulamalarda güvenle kullanılabilirler Literatürde benzer örnekleri bulunan RBP-temelli tanı sistemleriyle karşılaştırıldığında, bu çalışma, Proteus spp. enfeksiyonlarının hızlı, duyarlı ve özgül teşhisinde kullanılabilecek biyo-tanıma platformları için önemli bir temel oluşturmaktadır. Ayrıca, bu reseptör bağlayıcı proteinler, yalnızca tanı amaçlı değil, aynı zamanda hedefe yönelik tedavi stratejilerinde, örneğin nanopartiküllere bağlanarak antimikrobiyal ajanların hedefe taşınmasında da kullanılabilecek biyolojik araçlar olarak öne çıkmaktadır.
Özet (Çeviri)
Aim: Proteus mirabilis and Proteus vulgaris are significant opportunistic pathogens implicated in serious clinical conditions such as catheter-associated urinary-tract infections (CAUTI), pyelonephritis, sepsis and stone formation. Their surface structures, biofilm-forming ability and rising antibiotic resistance complicate both diagnosis and treatment. The principal aim of this dissertation is the recombinant production and comprehensive evaluation of the diagnostic potential of the receptor-binding proteins (RBPs) Gp35 and Gp106, derived from the P. mirabilis phage RP6 and the P. vulgaris phage RP7, respectively. The study characterised these proteins in terms of specificity, sensitivity, binding spectrum, performance in biological matrices, phage-adsorption blocking capacity and absence of antibacterial or cytotoxic effects. Materials and Methods: Gene sequences encoding Gp35 and Gp106 proteins were amplified by PCR with specific primers and cloned into the pET-30a(+) expression vector. After verification of cloning, the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified by Ni-NTA affinity chromatography. Proteus-specific binding of the purified RBPs was analysed by crystal-violet staining and ELISA. Competitive ELISA (C-ELISA) with varying bacterial loads determined detection limits, while binding spectra were assessed using 49 clinical isolates. Binding performance in urine and other biological matrices was examined, and competitive adsorption assays evaluated whether the recombinant proteins bind the same receptors as their cognate phages. Antibacterial activities of recombinant proteins were investigated with spot-test analysis, and cytotoxicity was assessed on human fibroblast (BJ) cells using the WST-1 assay. Results: Gp35 and Gp106 bound exclusively to Proteus isolates and produced no signal with heterologous bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus). In C-ELISA sensitivity tests, both proteins achieved target-specific binding at ≈10³ CFU mL⁻¹. Binding-spectrum analysis showed attachment of Gp35 to 82.5 % and Gp106 to 90 % of Proteus isolates, indicating a broader host range for Gp106. In several isolates, the RBPs bound despite the inability of their corresponding phages to infect, suggesting that RBP-based diagnostics may offer wider coverage than phage assays. In biological samples, the RBPs retained specificity and bound successfully to target bacteria in urine. Competitive adsorption assays revealed that Gp35 and Gp106 inhibited RP6 and RP7 phage attachment to host cells by 65–80 %, demonstrating that both proteins occupy the same specific receptors and can block phage infection. Neither RBP exhibited antibacterial activity, confirming their sole function in target recognition and binding, and neither displayed cytotoxicity toward human fibroblast (BJ) cells. Conclusion: This thesis presents the first systematic characterisation of Proteus-specific recombinant RBPs. Gp35 and Gp106 combine high specificity, broad spectrum, compatibility with clinical samples and confirmed target-receptor recognition, making them strong candidates for diagnostic applications. Their lack of antibacterial or cytotoxic effects permits safe use in assays that require viable cells. Compared with other RBP-based diagnostic systems reported in the literature, this study lays an important foundation for rapid, sensitive and specific detection of Proteus infections. Beyond diagnostics, these RBPs also hold promise as biological tools in targeted-therapy strategies—such as conjugation to nanoparticles for directed delivery of antimicrobial agents.
Benzer Tezler
- Gen transferinden hayvancılıkta yararlanma yolları
The Ways of using the gene transfer in animal breeding
SAİM BOZTEPE
- Detection of deletion mutations in duchenne muscular dystrophy patients by DNA analysis
Başlık çevirisi yok
ESRA İŞÇEN
- Organofosforlu insektisitlerden DDVP (dichlorvas)'nin drosophila melanogaster üzerindeki bazı genetik etkileri
Başlık çevirisi yok
HATİCE NEVAL ERTÜRK
