Geri Dön

Restoration of vancomycin sensitivity using antisense RNA and investigation of its efficacy in vancomycin-resistant Enterococci in infected mice

Antisens RNA kullanarak vankomisin hassasiyetinin restorasyonu ve vankomisin dirençli Enterokok ile enfekte farelerde etkinliğinin araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 970998
  2. Yazar: MELİS YALÇIN BENLİ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji, Biyoteknoloji, Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Bakteriyel enfeksiyonlar, RNA interferaz, Bacterial infections, RNA interference
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Amaç: vanA/vanB genlerini hedefleyen plazmid-kodlu antisens RNA (asRNA) yaklaşımları kullanarak vankomisin-dirençli Enterococcus suşlarında duyarlılığı geri kazandırmak ve deneysel fare modeliyle in vivo etkinliğini incelenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: vanA ve vanB genleri sırasıyla klinik E. faecium VRE50 ve E. faecalis V583'ten PCR ile çoğaltılmıştır, ardından restriksiyon enzim bölgeleri vasıtasıyla antisens RNA'lar üretmek için pUC19 plazmidine ters klonlanmıştır. Ters yönlendirilmiş genlere sahip bu oluşturulmuş plazmidler E. coli DH10B'ye transforme edilmiştir. Daha sonra, vanA ve vanB için asRNA'lar izole edilmiş ve vankomisin duyarlılığını geri kazandırma yetenekleri vankomisin varlığında in vitro test edilmiştir. Vankomisin MİK'i asRNA ile veya asRNA olmadan yapılmıştır ve 24 saatlik OD595 ölçümleri büyüme eğrileri oluşturmak için alınmıştır. İn vivo analiz için, lipozom kapsüllenmiş ve serbest asRNA'lar vankomisin ile VRE ile enfekte CD-1 farelerine intraperitoneal olarak uygulanmış ve tedavi sonuçları periton sıvısındaki bakteri yüklerini hesaplamak için CFU ölçülerek değerlendirilmiştir. Ek olarak, farelerin fare sepsis skorları günlük olarak kaydedilmiştir ve belirlenmiştir. Bulgular in vitro sonuçlara göre antibiyotik duyarlılık testleri, klinik VRE50 suşunda vanA-antisens RNA'yı ifade eden füzyon plazmidi aracılığıyla, vahşi tip suşta >256 µg/mL olan vankomisin MIC değerinin 32 µg/mL'ye düştüğünü gösterirken; vanB-antisens RNA ile E. faecalis V583'ün 64 µg/mL olan vankomisin MIC değeri 16 µg/mL'ye düşmüştür. Büyüme kinetiği analizleri, antisens RNA'yı ifade eden VRE suşlarında gecikme fazının uzadığını ve büyüme hızının azaldığını ortaya koyarak, direnç gen ekspresyonunun fonksiyonel olarak baskılandığını desteklemiştir. Fare sepsis modelinde intraperitonal antisens RNA ve vankomisin kombinasyonu ile tedavi edilen farelerde peritoneal sıvıdaki bakteri yükü anlamlı derecede azalmış ve klinik skorlar kontrol gruplarına kıyasla iyileşmiştir. Liposom formülasyonları in vivo uygulama için test edilmesine rağmen, muhtemelen yetersiz alım ya da gecikmeli salım nedeniyle terapötik etkinlikleri sınırlı kalmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde, bu bulgular antisens RNA konstrüksiyonlarının hem in vitro hem de in vivo ortamda van gen fonksiyonunu etkin bir şekilde baskılayarak antibiyotik duyarlılığını geri kazandırdığını ve enfeksiyon şiddetini azalttığını göstermektedir. Sonuç: Bu çalışma, vanA ve vanB genlerini hedefleyen plazmid kaynaklı antisens RNA'ların hem in vitro hem de in vivo ortamlarda vankomisin dirençli Enterococcus suşlarını yeniden antibiyotiğe duyarlı hale getirebildiğini göstermektedir. Genom düzenleme gerektirmeyen, geri dönüşümlü ve özgül bir baskılama mekanizması sunan antisens RNA teknolojisi, antimikrobiyal dirençle mücadelede yeni ve umut verici bir yaklaşım olarak öne çıkmaktadır. Bu strateji, sadece VRE'ye karşı değil, çoklu ilaca dirençli diğer patojenlerdeki direnç genlerine karşı da potansiyel uygulama alanlarına sahiptir.

Özet (Çeviri)

Purpose: This study aimed to restore susceptibility in vancomycin-resistant Enterococcus strains using plasmid-encoded antisense RNA (asRNA) of the vanA/vanB genes, and to examine their in vivo efficacy in an experimental mouse model. Materials and Methods: The vanA and vanB genes were amplified by PCR from clinical E. faecium VRE50 and E. faecalis V583, respectively, then reverse cloned into pUC19 plasmid to generate antisense RNAs via restriction enzyme sites. These constructed plasmids with reversly oriented genes were transformed into E. coli DH10B. Then, asRNAs, for vanA and vanB were extracted and their abilities to restore vancomycin susceptibility were tested in vitro in the presence of vancomycin. The vancomycin MIC was done with or without asRNA and during 24-hour OD595 measurements were taken over 24 hours to generate growth curves. For in vivo analysis, liposome encapsulated and free asRNAs were administered intraperitoneally to VRE-infected CD-1 mice with vancomycin, and treatment outcomes were assessed by measuring CFU to calculate bacterial loads in peritoneal fluid. Additionally, murine sepsis scores of the mice were recorded and determined daily. Results: Acording to in vitro studies, while antibiotic susceptibility tests showed a remarkable reduction in vancomycin MIC values, decreasing from >256 µg/mL in the wild-type strain to 32 µg/mL in expressing vanA-antisense RNA by fusion plasmid in clinical VRE50, vanB-asRNA reduced in vancomycin MIC value from 64 µg/mL (MIC value of E.faecalis V583) to 16 µg/mL. Growth kinetics analyses revealed extended lag phases and reduced growth rates in antisense-expressing VRE strains, supporting the functional repression of resistance gene expression. In the murine sepsis model, mice treated with the combination of intraperitoneal antisense RNA and vancomycin exhibited significantly lower bacterial burdens in peritoneal fluid and improved clinical scores compared to control groups. While liposomal formulations were tested for in vivo delivery, their therapeutic efficacy appeared limited, possibly due to insufficient uptake or delayed release. Collectively, these results indicate that antisense RNA constructs can effectively impair van gene function both in vitro and in vivo, restoring antibiotic susceptibility and attenuating infection severity. Conclusion: This study demonstrates that plasmid-derived antisense RNAs targeting the vanA and vanB genes can effectively resensitize vancomycin-resistant Enterococcus strains both in vitro and in vivo. As a reversible and highly specific gene-silencing approach that does not require genome editing, antisense RNA technology emerges as a promising new strategy in the fight against antimicrobial resistance. Beyond its application to VRE, this method holds potential for targeting resistance genes in a wide range of multidrug-resistant pathogens.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    123993

    Antibiyotik yüklü allogreftler ve biyopolimerik mikropartiküllerin enfekte kemik defektlerine implantasyonu ve etkinliklerinin değerlendirilmesi

    Implantation of antibiotic impregnated allografts and biopolymeric microparticles to infected bone defects and determination of their efficiency

    BURCU SAYIN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2003

    Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe Üniversitesi

    Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. BÜLENT ATİLLA

    PROF.DR. SEMA ÇALIŞ

  2. Tez No

    840696

    The effect of akkermansia muciniphila on gut bacterial microbiome, and proinflammatory response, in experimental campylobacter jejuni infection of mice

    Farelerde campylobacter jejuni ile oluşturulan deneysel enfeksiyonda akkermansia muciniphila'nın bağırsak bakteriyel mikrobiyomu ve inflamatuvar yanıt üzerine etkisi

    KUTAY ŞEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    MikrobiyolojiErciyes Üniversitesi

    Veterinerlik Mikrobiyolojisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEÇİL ABAY

  3. Tez No

    681422

    Dört farklı adeziv materyalin antibakteriyel etkilerinin farklı zaman periyotlarında karşılaştırılarak değerlendirilmesi

    Evaluation of the antibacterial effects of four different adhesive materials in different time periods

    SAMİCAN ÜNAL

    Diş Hekimliği Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Diş HekimliğiDicle Üniversitesi

    Restoratif Diş Tedavisi Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞEYHMUS BAKIR

  4. Tez No

    9603

    Restoration of motion degraded and blurred images

    Başlık çevirisi yok

    ELİF BAKTIR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1990

    Elektrik ve Elektronik MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MURAT AŞKAR

  5. Tez No

    76024

    Restoration of the Kızılören Han near Konya

    Konya yakınındaki Kızlören Han'ın restorasyonu

    ZEYNEP ALP KARAOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1998

    MimarlıkOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Mimarlık Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞIL TÜKEL YAVUZ

Geri Dön