Sıçanlarda paratiroit ve tiroit dokusuna özgü referans gen belirlenmesi
Identification of reference genes specific to parathyroid and thyroid tissues in rats
- Tez No: 974971
- Danışmanlar: DOÇ. DR. BEYZA SERVET GÖNCÜ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Bezm-İ Alem Vakıf Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Gen ekspresyon analizleri, moleküler biyoloji ve biyoteknoloji alanlarında genlerin fonksiyonel rollerini transkripsiyonel düzeyde anlamak için en temel ve güçlü yöntemlerden biridir. Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu, bu analizler için yüksek hassasiyeti, hızı ve güvenilirliği sayesinde en sık tercih edilen teknikler arasında yer almaktadır. Ancak, GZ-PZR verilerinin doğruluğu, gen ekspresyon düzeylerini standardize etmek amacıyla kullanılan referans genlerin doğru seçimine ve stabilitesine doğrudan bağlıdır. İdeal bir referans genin, farklı doku tipleri, fizyolojik koşullar ve deneysel gruplar arasında sabit bir ekspresyon seviyesini koruması gerekmektedir. Referans gen seçimindeki hatalar, gen ekspresyon verilerindeki gerçek değişimlerin yanlış yorumlanmasına ve hatalı biyolojik sonuçlara yol açabilir. Bu çalışmada, tiroit ve paratiroit dokularına özgü genler olan tiroglobulin (TG) ve parathormon (PTH) ekspresyonunun güvenilir bir şekilde normalizasyonu için en uygun referans genlerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Çalışma kapsamında Sprague-Dawley ve Wistar olmak üzere iki farklı sıçan ırkı ve her iki ırka ait erkek ve dişi bireyler kullanılmıştır. Aday referans gen olarak RPLP13A, PGK1, SDHA, TBP, HPRT1, GAPDH, YWHAZ, VCL, ve ACTB genleri seçilmiş ve ekspresyon stabiliteleri dört farklı biyoinformatik algoritma (BestKeeper, NormFinder, GeNorm ve Delta Ct metodu) kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Bu çok yönlü yaklaşım, her bir genin farklı deneysel koşullardaki performansını detaylı bir şekilde değerlendirme imkanı sunmuştur. Elde edilen sonuçlar, referans gen stabilitesinin evrensel bir özellik olmadığını, aksine incelenen biyolojik değişkenlere (ırk ve cinsiyet) bağlı olarak önemli ölçüde farklılıklar gösterdiğini net bir şekilde ortaya koymuştur. RefFinder arayüzü ile yapılan bütüncül sıralama analizleri, bu farklılıkları somutlaştırmaktadır. Seçilen dokuz aday gen içerisinden; PGK1, HPRT1, YWHAZ, VCL genlerine ait Ct değerleri 38'den büyük olması sebebiyle tüm stabilite analizlerinde dışlanmıştır. Erkek sıçanlarda ACTB (geometrik ortalama: 1,68) ve SDHA (geometrik ortalama: 1,86) genleri en yüksek stabiliteye sahip referans genler olarak belirlenirken, dişi sıçanlarda SDHA (geometrik ortalama: 1,19) ve TBP (geometrik ortalama: 2,45) genlerinin daha üstün bir stabilite profili sergilediği görülmüştür. Bu bulgu, cinsiyetin gen ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkisinin altını çizmekte ve gen ekspresyon normalizasyonunda bu faktörün göz ardı edilmemesi gerektiğini vurgulamaktadır. Irk bazlı değerlendirmelerde de benzer değişkenlikler saptanmıştır. Sprague-Dawley sıçanlarında TBP ve ACTB genleri stabilite açısından öne çıkarken, Wistar sıçanlarında SDHA ve TBP genleri daha yüksek stabilite değerleri elde etmiştir. Bu durum, referans gen seçiminde türler arası validasyonun gerekliliğini göstermektedir. Ayrıca, geleneksel olarak“housekeeping”gen olarak kabul edilen GAPDH'nin, incelenen tüm deneysel koşullar ve analiz yöntemlerinde en düşük stabiliteyi göstermesi dikkat çekicidir. Bu bulgu, GAPDH gibi yaygın genlerin otomatik olarak referans gen olarak kullanılmasının sonuçları yanlış veya eksik yorumlamaya neden olabileceğini kanıtlamaktadır. Bu çalışmanın sonuçları, GZ-PZR tabanlı gen ekspresyon analizlerinde güvenilirliğin artırılması için referans gen validasyonunun mutlak bir gereklilik olduğunu göstermektedir. Bulgularımız doğrultusunda, Sprague-Dawley ve Wistar sıçanlarının tiroit ve paratiroit dokularındaki gen ekspresyon çalışmalarında, normalizasyon için SDHA ve TBP genlerinin birinci tercih olarak kullanılması önerilmektedir. Ancak, en güvenilir sonuçlar için, çalışmanın spesifik biyolojik koşullarına (örneğin, erkek sıçanlar için ACTB ve SDHA, dişi sıçanlar için SDHA ve TBP) uygun referans gen kombinasyonlarının seçilmesi kritik önem taşımaktadır. Ayrıca, gen ekspresyon verilerinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini en üst düzeye çıkarmak için tek bir analitik yönteme bağlı kalmak yerine, BestKeeper, NormFinder ve GeNorm gibi çoklu algoritmaların birlikte kullanılması tavsiye edilmektedir. Bu çalışmada, tiroit ve paratiroit araştırmaları için daha sağlam bir moleküler profilleme çerçevesi sunmakta ve gelecekte bu dokularda gen ekspresyonu analizleri yapacak araştırmacılar için değerli bir referans oluşturmaktadır.
Özet (Çeviri)
Gene expression analysis stands as one of the most powerful and fundamental tools in molecular biology and biotechnology to unravel the functional activity of genes at the transcriptional level. Among the various methods, quantitative real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) is highly favored for its exceptional sensitivity, speed, and reliability in measuring relative gene expression levels. However, the accuracy of qRT-PCR results hinges critically on the appropriate selection and stability of reference genes, also known as housekeeping genes, which are used to normalize expression data. An ideal reference gene must maintain a constant expression level across different experimental groups, tissue types, and physiological conditions. The use of an unsuitable reference gene can introduce significant variability, leading to the misinterpretation of gene expression data and, ultimately, to incorrect biological conclusions. The primary objective of this thesis was to identify the most suitable reference genes for the reliable normalization of thyroglobulin (TG) and parathyroid hormone (PTH) expression, which are specific molecular markers for thyroid and parathyroid tissues, respectively. The study utilized both male and female individuals from two different rat strains, Sprague-Dawley and Wistar, to investigate potential variations in reference gene stability based on sex and strain. Nine candidate reference genes— RPLP13A, PGK1, SDHA, TBP, HPRT1, GAPDH, YWHAZ, VCL, and ACTB —were chosen for a comprehensive stability analysis. The expression stability of these genes was evaluated using a multi-algorithmic approach, integrating data from four widely recognized bioinformatics tools: BestKeeper, NormFinder, GeNorm, and the Delta Ct method. This robust strategy allowed for a detailed assessment of each gene's performance under various experimental conditions. The findings unequivocally demonstrated that reference gene stability is not a universal characteristic. Instead, it varies significantly depending on the biological variables examined, namely sex and strain. The comprehensive ranking analysis performed with the RefFinder tool provided a clear picture of these differences. Among the nine selected candidate genes, Ct values greater than 38 for the PGK1, HPRT1, YWHAZ, and VCL genes led to their exclusion from the stability analysis. In male rats, ACTB (geometric mean: 1.68) and SDHA (geometric mean: 1.86) were identified as the most stable reference genes, while in female rats, SDHA (geometric mean: 1.19) and TBP (geometric mean: 2.45) exhibited a superior stability profile. This sex-specific difference, particularly the notable decrease in ACTB's stability in females compared to males, underscores the crucial influence of sex on gene expression levels and highlights the necessity of considering this factor during the normalization process. Strain-specific analyses revealed similar variations. In Sprague-Dawley rats, TBP and ACTB genes demonstrated the highest stability, whereas in Wistar rats, SDHA and TBP genes were found to be more stable. This disparity highlights the importance of validating reference genes on a strain-by-strain basis to ensure the reliability of experimental outcomes. Furthermore, a highly significant finding was that GAPDH, a gene traditionally considered a universal housekeeping gene, displayed the lowest stability values across all groups and analytical methods examined in this study. This result challenges the conventional assumption of its suitability and provides strong evidence that the unvalidated use of GAPDH as a reference gene can lead to flawed or incomplete interpretations of results. In contrast, SDHA and TBP, which are involved in fundamental cellular processes such as the Krebs cycle and transcription initiation, generally exhibited high stability and consistency throughout the study. This research, therefore, provides a strong argument for the indispensable role of reference gene validation in qRT-PCR-based gene expression analyses. The results suggest that for studies involving thyroid and parathyroid tissues in Sprague-Dawley and Wistar rats, SDHA and TBP should be considered the primary choices for normalization. For optimal reliability, it is imperative that researchers select reference gene combinations tailored to their specific biological groups and experimental conditions. For instance, the study recommends using ACTB and SDHA for male rats, and SDHA and TBP for female rats. The automatic use of GAPDH without prior validation is strongly discouraged in these and similar experimental models due to its observed instability. To maximize the accuracy and reproducibility of gene expression analyses, the thesis recommends a multi-algorithmic approach, as employed in this study. Relying on a single algorithm may not provide a complete picture of gene stability. Instead, a comparative evaluation of results from multiple tools like BestKeeper, NormFinder, and GeNorm is crucial for establishing a truly robust and reliable set of reference genes. In summary, this thesis demonstrates that the selection of an appropriate reference gene is a decisive factor in the integrity of qRT-PCR-based gene expression analysis. The comprehensive, multi-algorithmic evaluation performed here identified SDHA and TBP as the most stable and reliable genes for normalization in the context of TG and PTH expression in rat thyroid and parathyroid tissues. The framework provided by this study contributes to more robust molecular profiling in thyroid and parathyroid research and serves as a valuable guide for future investigations into tissue-specific gene expression using real-time PCR. This work's emphasis on the necessity of experimental validation for reference genes underscores its importance in ensuring the scientific rigor and reproducibility of gene expression studies.
Benzer Tezler
- Prenatal dönemde dihekzil fitalat ve disiklohekzil fitalata maruziyetin erkek ve dişi sıçanların bazı endokrin dokuları üzerindeki etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of dihexyl phthalate and dicyclohexyl phthalate exposure through the prenatal period on the some endocrine tissues of male and female offspring rats
EMRE GÖKTEKİN
- Gebelik süresince uygulanan oktilfenolün ergin sıçanlarda endokrin sistem üzerindeki histopatolojik etkileri
Histipathological effects of octylphenol treatment through the pregnancy period, on the endocrine system of adult rats
EMRE GÖKTEKİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
BiyolojiHacettepe ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. NURHAYAT BARLAS
- Poli klorlu bifenillerin dişi sıçanlarda kemik dokusu, paratiroid hormonu, kalsitonin ve kemik dönüşüm parametreleri üzerine etkileri
Effect of polychlorinated biphenyls bone tissue, parathyroid hormone, calcitonin, bone turnover parameters at adult female rats
AYŞE SEYRAN
- Sistemik yoldan zoledronik asit uygulanan sıçanlarda lokal olarak uygulanan paratiroid hormonunun kemik iyileşmesi üzerine olan etkisinin histopatolojik olarak incelenmesi
Histopathological evaluations to investigate the effect of locally applied parathyroid hormone on bone healing in rats which were systemically treated with zoledronic acid
AYŞEGÜL ERTEN
Doktora
Türkçe
2015
Diş Hekimliğiİstanbul ÜniversitesiAğız, Diş ve Çene Cerrahisi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET CAN TUSKAN
- Lokal paratiroid hormon uygulamasının ortodontik diş hareketleri üzerinde olan etkisinin incelenmesi
The Effect of local parathyroid hormone on orthodontic tooth movement in rats
M. CEM CANİKLİOĞLU