Geri Dön

Determination of the atomic structure of Bag-1S:p97/VCP interaction, an important complex for ubiquitin-dependent degradation mechanism in breast cancer

Meme kanserinde ubikitin bağımlı yıkım mekanizması açısından önemli bir kompleks olan Bag-1S:p97/VCP etkileşiminin atomik düzeyde yapısının belirlenmesi

  1. Tez No: 975758
  2. Yazar: EZGİ BAŞTÜRK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyofizik, Biyoloji, Biochemistry, Biophysics, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Biyokimya, Moleküler biyoloji, Biochemistry, Molecular biology
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Protein homeostazisi (proteostazi), hücre içi protein dengesinin korunmasını sağlayan hayati bir süreçtir. Bu sistem, proteinlerin doğru şekilde katlanması, uygun yerlere taşınması ve hücresel işlevlerini tamamladıktan sonra zamanında yıkıma uğramasını kapsayan çok katmanlı bir denetim ağıdır. Proteostazi, başta moleküler şaperonlar olmak üzere, ubikitin-proteazom sistemi (UPS) ve endoplazmik reticulum-ilişkili yıkım (ERAD) gibi mekanizmalar tarafından sağlanır. AAA+ ATPaz ailesine mensup olan p97/VCP proteini, bu ağın merkezinde yer alır. p97, yanlış katlanmış veya artık işlevini yitirmiş proteinleri çeşitli hücresel ortamlardan uzaklaştırarak proteazoma yönlendirir ve böylece hücresel proteotoksik stresin önlenmesine katkı sağlar. Grubumuz tarafından daha önce gerçekleştirilen kütle spektrometresi tabanlı interaktom analizlerinde, ko-şaperon ailesinden Bag-1 proteininin küçük izoformu olan Bag-1S'nin p97 ile etkileşimde bulunduğu keşfedilmiştir. Bu bulgu, Bag-1S:p97 kompleksinin yapısal ve işlevsel özelliklerini anlamak üzere başlattığım doktora tez çalışmasının temelini oluşturmuştur. Bu tez kapsamında, söz konusu etkileşimin doğrulanması, bağlanma bölgelerinin tanımlanması ve hücresel düzeydeki fonksiyonel sonuçlarının anlaşılması hedeflenmiştir. İlk olarak, Bag-1S ve p97 arasındaki doğrudan etkileşim farklı biyokimyasal yöntemler kullanılarak doğrulanmıştır. Saflaştırılmış proteinlerle gerçekleştirilen ortogonal in vitro bağlanma deneyleri sonucunda, Bag-1S'nin p97 ile in vitro koşullarda bağlandığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar, proteinler arası fiziksel bir etkileşimin mevcut olduğunu doğrulamış ve yapısal analizler için temel oluşturmuştur. Fonksiyonel açıdan Bag-1S, paradoksal bir düzenleyici profil sergilemiştir: p97 ATPaz aktivitesini artırmasına rağmen, meme kanseri hücrelerinde ERAD substratı CD147(CG) yıkımını yavaşlatmış ve CB-5083 ile gözlenen fenotipe benzer şekilde farmakolojik inhibisyonu taklit etmiştir. Domen analizleri, UbL domeninin ATPaz aktivitesini baskıladığını, BAG domeninin ise tek başına anlamlı bir etki göstermediğini ortaya koyarak domenler arası iş birliğinin zorunluluğunu vurgulamıştır. Bulgular, Bag-1S proteininin, p97 aracılığıyla gerçekleşen substrat yıkım sürecini yavaşlattığını ve böylece p97'nin fonksiyonunu negatif yönde düzenleyebileceğini göstermiştir. Bu sonuçlar, Bag-1S'nin proteostazi üzerinde düzenleyici bir rol oynayabileceğine işaret etmektedir. Daha sonra, etkileşim yüzeylerinin belirlenmesi amacıyla hidrojen/döteryum değişimi-kütle spektrometresi (HDX-MS) analizleri uygulanmıştır. Bu analizler, hem tam uzunlukta Bag-1S hem de onun UbL ve BAG domenleriyle p97 arasındaki etkileşimi incelemek amacıyla yapılmıştır. HDX-MS verileri, p97 bağlandığında özellikle UbL domenine karşılık gelen 43–60 ve 78–92 ile BAG domenine karşılık gelen 160–170 arası bölgelerde nükleotitten bağımsız bir şekilde korunma gözlemlendiğini ortaya koymuştur. Ek olarak, 45–57 ve 56–71 arası bölgelerde de bazı deney koşullarında koruma saptanmış, bu da bağlanmanın çoklu ve olası geçici temaslar üzerinden gerçekleştiğini düşündürmüştür. Öte yandan, HDX-MS analizlerinde p97 üzerinde anlamlı bir konformasyonel değişim gözlemlenememiştir. Bu durum, bağlanmanın p97'nin üzerinde lokal ancak düşük yüzey alanlı ve geçici temaslarla gerçekleştiğini veya bağlanma sonrası konformasyonel değişimin HDX-MS hassasiyetiyle saptanamayacak kadar minimal olduğunu düşündürmektedir. Etkileşim bölgelerinin ortogonal olarak haritalanması amacıyla çapraz bağlama-kütle spektrometresi (XL-MS) analizleri gerçekleştirilmiştir. DSBU-temelli XL-MS analizleri sonucunda, UbL domenine karşılık gelen 81–106 ve 120–137 bölgelerinde p97 ile temas oluştuğunu, ayrıca BAG domeninden 165–190 aralığında da çapraz bağların mevcut olduğunu ortaya koymuştur. Bu veriler, Bag-1S'in p97'ye iki ayrı domen üzerinden bağlandığını doğrulamış ve HDX-MS bulgularını desteklemiştir. DSBU-temelli XL-MS analizi, bağlanan proteinler arasında doğrudan kovalent bağlar oluşturduğu için, yalnızca Bag-1S üzerindeki değil, p97 üzerindeki etkileşim bölgelerinin de belirlenmesini mümkün kılmıştır. Elde edilen çapraz bağlar, p97'nin N-ucu domenine (NTD) karşılık gelen 1–8, 54–62 ve 211–217 bölgelerinde yoğunlaşmıştır. Bu veriler, p97'nin esnek yapıya sahip NTD domeninin Bag-1S tarafından hedeflendiğini ve bu bölgenin bilinen diğer etkileşim partnerleriyle etkileşimde de kritik olduğunu desteklemektedir. Ayrıca, HDX-MS analizlerinde p97 üzerinde anlamlı bir korunma tespit edilememiş olması, bu yöntemin N-ucu bölgesinin dinamik yapısı nedeniyle sınırlı çözünürlük sunabileceğini göstermektedir. Bu bağlamda, XL-MS yaklaşımı, p97'nin Bag-1S ile temas yüzeylerini amino asit düzeyinde haritalandırarak etkileşimin yapısal temelini daha detaylı şekilde ortaya koymuştur. HDX-MS ve XL-MS verileri birlikte ele alındığında, UbL (43–60, 78–92) ve BAG (160–170) bölgelerinin p97 NTD (1–8, 54–62, 211–217) ile etkileştiğini ortaya koymuştur. BAG domeni üzerinde yer alan RR161–162 motifinin önemi, önceki çalışmalarımızda da vurgulanmıştır. Önceki çalışmamızda, BAG domeninin C-ucunda yer alan RR161–162 motifinin, p97 ile kurulan etkileşimde hayati bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu motifin tekli nokta mutasyonlarına uğratılması (R161D ve R162E), yalnızca p97 bağlanmasını engellemekle kalmamış, aynı zamanda Bag-1S'nin proteazomal parçalanma sürecini yönlendirme kapasitesini de ortadan kaldırmıştır. Bu sonuç, söz konusu motifin p97 aracılığıyla gerçekleşen proteostazi düzenlemesinde hem yapısal hem de işlevsel bakımdan merkezî bir konuma sahip olduğunu göstermektedir. Bu tez kapsamında elde edilen bulgular, söz konusu önceki verilerle birleştiğinde, RR motifinin p97 aracılığıyla proteazomal hedeflemeyi ve ATPaz aktivitesini kontrol eden önemli bir düzenleyici merkez olduğunu ileri sürmektedir. BAG domeni üzerinde yer alan RR161–162 motifinin bu tez kapsamında yapılan ikili mutasyonu (RR161–162DE), hem p97 bağlanmasını hem de ATPaz aktivitesine olan etkisini ortadan kaldırmıştır. Bu bulgu, bu motifin bağlanma için kritik olduğunu ve işlevsel sonuçlara doğrudan katkı sunduğunu göstermektedir. Translasyonel açıdan, yapılan öncü deneyler Bag-1S:p97 etkileşiminin terapötik potansiyeline işaret etmektedir. RR-motifi türevli bir peptit, 'emetine chase' deneylerinde CD147(CG)'nin kısmi stabilizasyonuna yol açmış; ancak BiP artışı düşük dozlarda gözlenmemiş, yalnızca yüksek konsantrasyonlarda (≥ 25 µM) ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, bu peptidin Bag-1S aracılı p97 regülasyonunu seçici olarak bozabileceği düşünülse de, bu bulgular öncü nitelikte olup ek tekrarlarla doğrulanmalıdır. Buna karşılık CB-5083, ATPaz aktivitesini geniş çapta inhibe ederek güçlü bir ERAD baskısı ve belirgin BiP artışı sağlamıştır. Dolayısıyla, peptit seçici ve kısmi bir etki gösterirken, CB-5083 küresel ve güçlü bir blokaja yol açmıştır. Ayrıca, öncü cryo-EM verileri p97 NTD'lerinde yüksek derecede heterojenlik ortaya koymuş, ancak XL–cryo-EM stratejileriyle Bag-1S:p97 komplekslerinin yapısal olarak yakalanabileceği gösterilmiştir. Bu sonuçlar, esnek komplekslerin yapısal olarak çözümlenmesinin mümkün olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çalışma kapsamında elde edilen tüm bu veriler, Bag-1S'in p97'ye hem UbL hem de BAG domenleri aracılığıyla bağlandığını ve bu çoklu bağlanmanın p97'nin ATPaz aktivitesi ile substrat işleme fonksiyonlarını etkilediğini ortaya koymuştur. Bu bağlanma, domen yapılarına bağlı olarak değişiklik göstermekte ve konformasyonel bir hassasiyet içermektedir. Ayrıca, Bag-1S'nin p97 ile etkileşimi sayesinde proteostazi ağında yeni bir düzenleyici katman sunduğu ve ERAD gibi hayati süreçleri modüle edebileceği öne sürülmektedir. Özellikle RR161–162 motifinin bağlanma ve işlevsel sonuçlar açısından merkezi bir rol oynadığı gösterilmiştir. Ayrıca, Bag-1S'nin p97'ye bağlanarak substrat yıkımını yavaşlattığı ve proteostazi üzerinde düzenleyici bir rol oynayabileceği belirlenmiştir. Bu bulgular, Bag-1S'nin, p97'nin substrat seçiciliği ve enzimatik aktivitesi üzerinde iki yönlü bir kontrol mekanizması oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, Bag-1S klasik bir Hsp70 kofaktöründen, p97'nin nonkanonik bir düzenleyicisine yeniden konumlandırılmaktadır. Çift bölgeli bağlanma ve çift yönlü modülasyon yoluyla proteostaziye ince ayar yapan Bag-1S, artık kanser ve proteostaziye bağlı diğer hastalıklar için terapötik olarak hedeflenebilir bir mekanizma olarak öne çıkmaktadır. Bu tez, Bag-1S:p97 etkileşiminin amino asit düzeyindeki temas noktalarını ve fonksiyonel sonuçlarını ilk kez ortaya koyarak hem mekanistik hem de translasyonel bir çerçeve sunmaktadır. Bu etkileşimin kanser hücrelerindeki regülasyon mekanizmalarıyla ilişkilendirilmesi, Bag-1S:p97 kompleksini terapötik hedef olarak değerlendirme potansiyelini artırmaktadır. Bu bağlamda, Bag-1S:p97 etkileşimi gelecekte küçük molekül veya peptit tabanlı stratejiler için temel bir model sunmaktadır.

Özet (Çeviri)

Protein homeostasis (proteostasis) is a vital cellular process that maintains the proper balance of protein synthesis, folding, localization, and timely degradation. This multilayered surveillance system is orchestrated by molecular chaperones, the ubiquitin–proteasome system (UPS), and endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) pathways. At the core of this network lies the AAA+ ATPase p97/VCP, which facilitates the clearance of misfolded or damaged proteins by extracting them from various subcellular compartments and targeting them for proteasomal degradation, thereby contributing to cellular proteotoxic stress mitigation. Mass spectrometry–based interactome analyses previously conducted by our group identified an interaction between p97 and the small isoform of the Bag-1 protein, Bag-1S, a co-chaperone family member. This discovery laid the foundation for this doctoral research, which aims to verify the interaction, delineate the binding interfaces, and elucidate the functional consequences of the Bag-1S:p97 complex at the cellular level. First, the direct interaction between Bag-1S and p97 was validated through a series of orthogonal biochemical approaches. In vitro binding assays using purified proteins confirmed that Bag-1S physically associates with p97, establishing a molecular basis for subsequent structural investigations. Functionally, Bag-1S exhibited paradoxical regulation: while enhancing p97 ATP hydrolysis in vitro, Bag-1S overexpression in MCF-7 cells delayed degradation of the ERAD substrate CD147(CG), phenocopying pharmacological inhibition. Domain dissection revealed opposing activities of the UbL (inhibitory) and BAG (neutral/stabilizing) modules, highlighting domain cooperativity as the basis for this dual regulation. The results demonstrated that Bag-1S attenuates p97-mediated substrate turnover, suggesting a negative regulatory effect on p97 function and pointing toward a broader role for Bag-1S in proteostasis regulation. To map the interaction interfaces, hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) was employed using both full-length Bag-1S and its individual domains (UbL and BAG). The data revealed protection upon p97 binding in different regions corresponding to residues 43–60 and 78–92 in the UbL domain and residues 160–170 in the BAG domain independent of nucleotide state. Additional protection was observed at residues 45–57 and 56–71 under certain conditions, implying that the interaction involves multiple and potentially transient contacts. In contrast, HDX-MS analyses did not detect any substantial conformational changes in p97 upon Bag-1S binding. This may reflect a highly localized, low-surface-area interaction that does not propagate significant structural rearrangements detectable by HDX-MS or may indicate transient binding events below the method's resolution. To complement HDX-MS and gain higher spatial resolution, disuccinimidyl di butyric urea (DSBU)–based cross-linking mass spectrometry (XL-MS) was applied. Cross-links were detected between the UbL domain of Bag-1S and p97 at residues 81–106 and 120–137, and between the BAG domain and p97 at residues 165–190. These data provided orthogonal validation of the dual-domain interaction and enabled localization of the contact regions at residue-level precision. Importantly, the covalent nature of XL-MS allowed identification of Bag-1S-interacting residues on p97 itself. Cross-links were observed in the p97 N-terminal domain (NTD), specifically at residues 1–8, 54–62, and 211–217. Given that the NTD is known to mediate interactions with numerous adaptors and regulatory partners, these findings underscore its functional significance in mediating Bag-1S binding. The absence of detectable protection in p97 via HDX-MS is likely attributable to the NTD's intrinsic flexibility, which limits the resolution of HDX-based methods in this region. Site-directed mutagenesis of the BAG domain further confirmed the functional relevance of the interaction. Substitution of the conserved RR161–162 motif with acidic residues (RR161–162DE) abrogated both p97 binding and the modulatory effect of Bag-1S on p97 ATPase activity. These results demonstrate that this motif is indispensable for complex formation and functional outcomes. Our previous study also highlighted the significance of this motif. In that work, mutation of the C-terminal RR161–162 motif disrupted not only p97 binding but also the ability of Bag-1S to direct proteasomal degradation, emphasizing its central regulatory role in proteostasis. When combined with the present findings, these results establish the RR motif as a critical hub for ATPase modulation and substrate handling through the Bag-1S:p97 axis. Preliminary perturbation assays further demonstrated translational potential. The RR-motif peptide stabilized CD147(CG) in a dose-dependent manner, while BiP elevation was restricted to higher concentrations (≥ 25 µM). Thus, we avoided over-interpreting these findings as general UPR induction and instead describe them as preliminary evidence that high-dose peptide treatment may perturb ER proteostasis. Complementary cryo-EM pilot datasets revealed pronounced NTD heterogeneity and disorder, but established proof-of-principle that Bag-1S:p97 complexes can be structurally captured using XL–cryo-EM approaches. To sum up, our data demonstrate that Bag-1S interacts with p97 via both its UbL and BAG domains and that this dual engagement modulates p97's ATPase activity and substrate processing functions. The interaction is conformation-dependent, highlighting the dynamic nature of the complex. Through its binding to p97, Bag-1S introduces an additional regulatory layer into the proteostasis network, with implications for ERAD modulation and cellular stress response pathways. Taken together, our data support a bipartite interaction between Bag‑1S and p97 that can influence ATPase activity in vitro and ERAD kinetics in cells. The direction and magnitude of this influence appear context‑dependent, and the preliminary peptide and cryo‑EM datasets are not yet sufficient for mechanistic or therapeutic claims. Additional replication and higher‑resolution measurements will be required to establish causality and scope. In conclusion, this thesis provides the first comprehensive structural and functional characterization of the Bag-1S:p97 interaction. The findings suggest that this complex plays a pivotal role in proteostasis regulation and may represent a novel therapeutic target in the context of cancer biology and protein quality control.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    270322

    1,2,4-triazol benzimidazol türevlerinin kristal yapıları ve yapı-aktivite ilişkilerinin X ışınlarıyla ve kuantum mekaniksel yöntemlerle incelenmesi

    Crystal structures and structure-activity relationships investigation by X-ray and quantum mechanical methods of new benzimidazole derivatives consisting of 1,2,4-triazole

    ARZU KARAYEL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Fizik ve Fizik MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Fizik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SÜHEYLA ÖZBEY

  2. Tez No

    75023

    Polivinil asetat kökenli termoplastik yapıştırıcıların radyasyonla çapraz bağlanarak iyileştirilmesi

    Başlık çevirisi yok

    M.KUDRET ARSEVEN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    Nükleer Mühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Nükleer Mühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALİ NEZİHİ BİLGE

  3. Tez No

    664572

    Coating of silver doped titanium by biodegradable pcl to delay antibacterial silver release in dental implants

    Diş implantlarındaki antibakteriyel gümüş salınımını geciktirmek için gümüş katkılı titanyumun biyoçözünür pcl ile kaplanması

    GİZEM ÖZGE KAYAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Metalurji Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MOHAMMADREZA NOFAR

  4. Tez No

    350557

    Plazma destekli kimyasal buhar biriktirme yöntemi ile tantal katkılı elmas benzeri karbon film üretimi ve karakterizasyonu

    Production of tantalum doped diamond-like carbon film by means of plasma assisted chemical vapor deposition and its characterisation

    NİLÜFER ORHON

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Metalurji Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. M. KÜRŞAT KAZMANLI

  5. Tez No

    22712

    C17H16N2O2Ni.H2O (N,N'-bis-disalisiliden Ni (II) bileşiğinin kristal yapısının çözümlenmesi

    Crystal structure determination of C17H16N2O2Ni.H2O N,N'-bis-di salycilidene-(1,3)-propan diamine-Nickel (II) complex

    MEHMET KABAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1992

    Fizik ve Fizik MühendisliğiAnkara Üniversitesi

    Fizik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. YALÇIN ELERMAN

Geri Dön