Leptospira sp.'nın Lipl32 antijeninin rekombinant dna teknolojisi kullanılarak Escherichia coli bakterisi ve Nicotiana benthamiana (tütün) bitkisinde üretimi ve alt birim aşı geliştirilmesi
Production of Lipl32 antigen of Leptospira sp. in both Escherichia coli and Nicotiana benthamiana (tobacco) plants by recombinant dna technology and development of subunit vaccine
- Tez No: 988325
- Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET HAKKI ALMA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Iğdır Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu doktora çalışmasının amacı, zoonotik bir patojen olan Leptospira türlerine karşı bağışıklık yanıtını uyarma potansiyeline sahip LipL32 antijeninin rekombinant formda üretilmesi ve bu proteinin alt birim aşı geliştirme sürecindeki uygulanabilirliğinin değerlendirilmesidir. Bu kapsamda, LipL32 geni hem bakteriyel [Escherichia coli BL21(DE3)] hem de bitkisel (Nicotiana benthamiana) ekspresyon sistemlerine klonlanarak rekombinant protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Bakteriyel sistemde, LipL32 geni pET-28a(+) vektörü aracılığıyla E. coli BL21(DE3) hücrelerine aktarılmış; rekombinant proteinin üretimi SDS-PAGE ve Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır. Bitkisel sistemde ise LipL32 genine N. benthamiana bitkisine uygun kodon optimizasyonu uygulanmış, PR-1a sinyal peptidi, endoplazmik retikulum (ER) tutma sinyali olan KDEL dizisi ve His6 etiketi eklenmiş ve gen pGAM001v2 vektörüne klonlanarak Agrobacterium tumefaciens EHA105 suşu aracılığıyla bitkilere aktarılmıştır. Bitkisel üretimde, LipL32 geninin ekspresyonu, glikozilasyonu azaltmak amacıyla PNGase F geni ve bitki savunma mekanizmalarını baskılayan p19 geni ile farklı oranlarda (5:4:1) karıştırılarak yapılan infiltrasyonlarla optimize edilmiştir. En yüksek ekspresyon düzeyi ve en düşük glikozilasyon oranı bu oranla elde edilmiştir. Dördüncü gün hasat edilen bitkilerden, Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılan LipL32 proteini yaklaşık 32 kDa büyüklüğünde, tek bir bant şeklinde SDS-PAGE ve Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır. Bu çalışma, Türkiye'de Leptospira türlerine karşı geliştirilen ilk rekombinant bitki temelli aşı adayı olması bakımından öncü niteliktedir. Ayrıca bakteriyel ve bitkisel ekspresyon sistemlerinin karşılaştırmalı analizini sunarak, farklı sistemlerin alt birim aşı üretimindeki potansiyelini ortaya koymaktadır. Elde edilen bulgular, LipL32 proteininin rekombinant üretiminin, Leptospira enfeksiyonlarına karşı etkili ve güvenli alt birim aşıların geliştirilmesi açısından umut verici bir yaklaşım sunduğunu göstermektedir.
Özet (Çeviri)
The aim of this doctoral study is to produce the LipL32 antigen, which has the potential to stimulate immune response against Leptospira species, a zoonotic pathogen, in recombinant form and to evaluate the applicability of this protein in the subunit vaccine development process. In this context, the LipL32 gene was cloned into both bacterial [Escherichia coli BL21(DE3)] and plant (Nicotiana benthamiana) expression systems and recombinant protein production was achieved. In the bacterial system, the LipL32 gene was introduced into E. coli BL21(DE3) cells using the pET-28a(+) vector, and the expression of the recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and Western Blot analyses. In the plant system, the LipL32 gene was codon-optimized for N. benthamiana expression and fused with a PR-1a signal peptide, a KDEL endoplasmic reticulum (ER) retention signal, and a His6 tag. It was then cloned into the pGAM001v2 vector and transferred into plants via Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. In plant production, expression of LipL32 gene was optimized by infiltrations mixed with PNGase F gene and p19 gene suppressing plant defense mechanisms at different ratios (5:4:1) in order to reduce glycosylation. The highest expression level and the lowest glycosylation rate were obtained with this ratio. LipL32 protein purified by Ni-NTA affinity chromatography from plants harvested on the fourth day was confirmed by SDS-PAGE and Western Blot analyses as a single band of approximately 32 kDa in size. This study represents the first recombinant plant-based vaccine candidate against Leptospira species developed in Türkiye. It also provides a comparative evaluation of bacterial and plant expression systems, highlighting the potential of both platforms in subunit vaccine production. The findings suggest that the recombinant production of LipL32 is a promising approach for the development of effective subunit vaccines against Leptospira infections.
Benzer Tezler
- Marmara Bölgesi'ndeki atların idrarlarında patojen leptospira'ların REAL-tıme PCR ile araştırılması
Başlık çevirisi yok
FİKRET MEMİŞOĞLU
Doktora
Türkçe
2017
Veteriner Hekimliğiİstanbul ÜniversitesiVeterinerlik Mikrobiyolojisi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NACİYE YAKUT ÖZGÜR
- Edirne ilindeki çevresel sularda kirlilik indikatörü mikroorganizmaların ve yeni çıkan bakteriyel patojenlerin moleküler yöntemlerle saptanması
Detection of pollution indicator microorganisms and emerging bacterial pathogens by using molecular methods in environmental water samples from Edirne region
MÜJDAT ÖZGÜR
- Sığırlarda brucella ve leptospira türlerinin multiplex polimeraz zincir reaksiyonu (MPCR) ile tanımlanması
Detection of Brucella and Leptospira by Multiplex Polymerase Chain Reaction in Cattle
UĞUR PARIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
MikrobiyolojiAdnan Menderes ÜniversitesiVeterinerlik Mikrobiyolojisi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ŞÜKRÜ KIRKAN
- Edirne ve çevresinde Lleptospira cinsi bakterilerin araştırılması.
Investigation of the genus Leptospira in Edirne and surroundings.
SÜLEYMAN DOĞRU