Holstein ırkı sığırlarda aborta ve yavru kayıplarına neden olan bazı kalıtsal hastalıkların tespiti için multipleks RT-PCR kiti geliştirilmesi
Development of a multiplex PCR kit to be used in the diagnosis of some hereditary diseases that cause abortion and calf deaths in Holstein cattle
- Tez No: 999093
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÖĞÜNÇ MERAL
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Genetik, Biochemistry, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Veterinerlik Biyokimyası Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Veteriner Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Dünya çapında, genetik kütüphanenin genişlemesi ve yüksek verimli hayvanların ıslahı için yapılan çalışmaların hız kazanmasıyla birlikte, morfolojik seleksiyon yerine çeşitli moleküler metotlarla yapılan seleksiyon çalışmaları sahadaki önemini artırmıştır. Damızlık olarak seçilen yüksek verimli boğaların spermaları, boğa besleme maliyetlerinden tasarruf etmek, depolama kolaylığı ve geniş coğrafyalarda kolaylıkla kullanımına elverişli olması açısından saklanmaya ve dünya çapında yayılmaya başlamıştır. Ancak bu durum genotipik çeşitliliğin azalmasına ve çeşitli kalıtsal hastalıkların dünya çapındaki frekanslarının artmasına neden olmuştur. Bu durum hayvancılık sektörünü ve dolayısıyla hayvansal gıdaların üretimi hususunu olumsuz yönde etkilemektedir. Özellikle süt işletmelerinde süt üretiminin yanında eşit derecede önemli olan bir diğer şey de yavru alımıdır. Ancak embriyonal ve fötal ölümlere, abortlara ve yavru kayıplarına neden olan kalıtsal hastalıkların frekansının artması, döl verimi ve yavru sağlığını da tehlike altına sokmuştur. Sığır lökosit bağlanma hastalığı (bovine leucocyte adhesion deficiency, BLAD), kompleks vertebral malformasyon (Complex vertebral malformation, CVM), Brahispina ve HH1, HH2, HH3 haplotipleri özellikle Holştayn ırkı sığırlarda arilik istenen hastalıklardır. Bu hastalıklardan arilik konusu Tarım ve Orman Bakanlığı tarafından da özellikle sıkı bir şekilde takip edilmektedir. Belirtildiği gibi moleküler tanı tekniklerinin sağladığı avantajlardan ıslah çalışmalarında da yararlanmak son derece rasyonel bir seçenektir. Bu tekniklerden gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real time PCR, RT-PCR), genetik tanı alanında en yaygın kullanılanlardan biridir. Bu çalışmada, literatürlere konu olan kalıtsal hastalıkların tespiti amacıyla üretilecek olan kitin de bu tekniğe uygun olarak geliştirilmesi ve ilgili kalıtsal hastalıklar arasından seçilen altı tanesinin tespitinin gerçek zamanlı olarak gerçekleştirildiği bir multipleks RT-PCR kiti tasarlanması amaçlanmıştır. Her bir haplotipin yabanıl ve mutant alelleri için sentetik pozitif kontrol oligonükleotitleri, primerler ve özgül problar tasarlanmıştır. HHB, HHC, HH1, HH2, HH3 hedeflerinin her biri için ortak birer ileri ve geri primer kullanılmıştır. HH0 mutant aleli 3,3 kb gibi büyük delesyon içerdiğinden yabanıl ve mutant tipler için ayrı primer setleri tasarlanmıştır. Optimizasyon çalışmalarına geleneksel tekli PCR yöntemi ile başlanmış ve amplifikasyon ürünleri jelde görüntülenip reaksiyon sonucu oluşan amplikonlar doğrulanmıştır. Her bir haplotipin iki alelinin aynı reaksiyonda analizi için amplifikasyon sonucu yıkımlanarak ışıma yapması prensibiyle çalışan florofor işaretli hidroliz probları kullanılmıştır. Reaksiyon kuyusunda bir arada teşhis edilecek her bir haplotipe ait iki alel için tasarlanan problardan biri FAM diğeri HEX boyalarla işaretlenmiştir. Tekli gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) çalışmalarıyla reaksiyon verimliliği incelenmiştir. Verimlilik ve saptama limiti tespitinde standart eğriye ilişkin parametreler kullanılmıştır. İkili qPCR'da ise kullanılan heterozigot, heterozigot mutant, homozigot yabanıl, negatif kontroller ve kalıp içermeyen kontrol grupları kullanılarak parametrelerin genomik DNA amplifikasyon parametreleriyle karşılaştırılması yapılmış ve end point analiziyle yorumlanmıştır. Bir qPCR çalışmasında karşılanması beklenen Cq, etkinlik, standart eğim, LOD ve LOQ değerleri, standart eğrinin regresyon analizinden faydalanılarak istenen aralıkta saptanmıştır.
Özet (Çeviri)
With the global expansion of genetic libraries and the acceleration of breeding programs aimed at high-yield animals, selection studies based on various molecular methods have gained prominence over traditional morphological selection approaches. Semen from high-yield bulls selected for breeding has been increasingly preserved and distributed worldwide due to advantages such as reduced costs associated with bull maintenance, ease of storage, and practical usability across broad geographical regions. However, this trend has led to a decrease in genotypic diversity and a global increase in the frequency of certain hereditary diseases. Consequently, this development has negatively impacted the livestock sector and, by extension, the production of animal-based food products. In dairy operations, calf acquisition is just as critical as milk production. The rising frequency of hereditary diseases causing embryonic and fetal mortality, abortions, and neonatal losses poses a significant threat to fertility and calf health. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD), complex vertebral malformation (CVM), brachyspina, and the HH1, HH2, and HH3 haplotypes are particularly concerning conditions for which genetic purity is desired, especially in Holstein cattle. The Ministry of Agriculture and Forestry closely monitors these conditions to ensure genetic health. As mentioned, leveraging the advantages of molecular diagnostic techniques in breeding programs is a rational strategy. Among these, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) is one of the most widely utilized techniques in genetic diagnostics. This study aimed to develop a multiplex RT-PCR kit designed to detect six selected hereditary diseases, commonly discussed in the scientific literature. For each wild-type and mutant allele of the target haplotypes, synthetic positive control oligonucleotides, primers, and specific probes were designed. A common forward and reverse primer pair was used for each of the HHB, HHC, HH1, HH2, and HH3 targets. Due to the large deletion (~3,3 kb) present in the HH0 mutant allele, separate primer sets were designed for wild-type and mutant alleles. Optimization studies began with conventional single PCR methods, and amplification products were visualized by gel electrophoresis to confirm the resulting amplicons. Fluorophore-labeled hydrolysis probes, which emit fluorescence upon degradation during amplification, were employed to simultaneously detect both alleles of each haplotype in the same reaction. For each haplotype, one probe was labeled with FAM and the other with HEX dye. Reaction efficiency was assessed using single real-time quantitative PCR (RT-qPCR), and parameters from standard curves were utilized to determine amplification efficiency and detection limits. In duplex qPCR experiments, heterozygous, homozygous wild-type, homozygous mutant, negative controls, and no-template controls were used to compare genomic DNA amplification parameters and interpret results via endpoint analysis. The Cq, efficiency, slope of the standard curve, LOD, and LOQ values that are expected to be met in a qPCR study were determined within the desired range by utilizing regression analysis of the standard curve.
Benzer Tezler
- Orta Anadolu şartlarında Holştayn ırkı sığırlarda bazı verim özellikleri
Some production traits of Holstein cows in Middle Anatolian conditions
ÖNDER SEHAR
Doktora
Türkçe
2004
Veteriner HekimliğiAnkara ÜniversitesiZootekni Ana Bilim Dalı
PROF.DR. CEYHAN ÖZBEYAZ
- Kayseri yöresindeki atık yapan sığırlarda brucella abortus, chlamydophıla abortus ve neospora canınum enfeksiyon oranlarının belirlenmesi
Determination of brucella abortus, chlamydophila abortus and neospora caninum infections ratio in aborted cattle in Kayseri province
HAKAN ARI
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Veteriner HekimliğiErciyes ÜniversitesiVeterinerlik İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZNUR ASLAN
- Farklı orijinli siyah alaca sığırların Trakya bölgesi koşullarındaki döl ve süt verimlerini etkileyen bazı faktörler üzerinde çalışmalar
Factors affecting fertility traits and milk yield of holstein cattle with different origins raised in Trakya region
BARAN MURAT ÖZDEMİR
Doktora
Türkçe
2020
Veteriner Hekimliğiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaVeterinerlik Zootekni Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA ÖZCAN
- Kayseri bölgesinde yetiştirilen holştayn sığırlarında kompleks vertebral malformasyon hastalığı geninin allel frekansının belirlenmesi
Determination of the frequancy of the allele in the gene causing the complex vertebral malformation in the holstein cows in the Kayseri region
GEVHER NESİBE KULAKLI
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
Veteriner HekimliğiErciyes ÜniversitesiVeterinerlik Zootekni Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. BİLAL AKYÜZ
- Holstein ırkı sığırlarda süt verim özelliklerinin işaretleyici yardımlı seleksiyonu
Marker assisted selection of milk traits on holstein cattle
BAHADIR SOYUDAL
Doktora
Türkçe
2017
GenetikUludağ ÜniversitesiVeterinerlik Zootekni Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FARUK BALCI