Geri Dön

Development and structural analysis of nanobodies targeting SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 hedefleyen özgün nanokorların geliştirilmesi ve yapısal analizleri

PDF İndir

  1. Tez No: 1000103
  2. Yazar: CEMRE CEREN GÜLBAHAR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyofizik, Biyokimya, Biyoloji, Biophysics, Biochemistry, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

SARS-CoV-2'nin konak hücrelere giriş mekanizması, viral Spike proteini üzerinde yer alan RBD ile konak hücre yüzeyinde bulunan ACE2 reseptörü arasındaki yüksek özgüllüğe sahip etkileşime dayanmaktadır. Bu protein-protein etkileşimi, viral membran füzyonunu tetikleyerek enfeksiyonun başlatılmasında kritik bir rol oynar. Bu nedenle, RBD–ACE2 etkileşimini doğrudan hedefleyen inhibitör stratejiler, antiviral yaklaşımlar kapsamında önemli bir araştırma alanı olarak öne çıkmaktadır. Tek domenli antikorlar olan nanokorlar, küçük boyutları, yüksek stabiliteleri ve erişilmesi zor epitoplara bağlanabilme yetenekleri sayesinde viral giriş mekanizmalarının engellenmesinde umut vadeden moleküller olarak değerlendirilmektedir. Bu tezin birinci bölümünde, RBD'yi hedefleyen peptit entegre edilmiş nanokorların rasyonel tasarımı, bakteriyel üretimi ve saflaştırılması ele alınmış; nanokorların yeniden tasarlanmasının konformasyon ve bağlanma mekanizmaları üzerindeki etkileri incelenmiştir. TÜBİTAK 1001 kapsamında yürütülen 120Z305 numaralı proje çerçevesinde, SARS-CoV-2 Spike proteinine ait RBD ile konak hücre reseptörü ACE2 arasındaki protein-protein etkileşim arayüzü ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu kritik etkileşim yüzeyini doğrudan hedeflemek amacıyla, RBD:ACE2 kompleksinin yapısal özellikleri temel alınarak özgül peptit dizileri rasyonel biçimde tasarlanmıştır. Tasarlanan peptitlerin bağlanma potansiyelleri ve arayüzle uyumları, moleküler modelleme ve simülasyon çalışmaları ile değerlendirilmiş; yapılan hesaplamalı analizler sonucunda RBD:ACE2 etkileşimini en etkili şekilde hedefleyebileceği öngörülen iki peptit adayının ileri deneysel çalışmalar için seçilmesine karar verilmiştir. ACE2:RBD etkileşim yüzeyi baz alınarak tasarlanan peptit dizileri, RBD:ACE2 bağlanma yüzeyini doğrudan hedeflemek amacıyla Ty1 nanokorunun CDR3 bölgesine entegre edilmiştir. Bu yapısal modifikasyon, β-tabaka ağırlıklı kanonik nanokor yapısının bağlanma afinitesini artırmak üzere tasarlanmıştır. Rekombinant refererans ve peptit entegre edilmiş nanokor proteinleri, afinite kromatografisi ile yüksek homojenlikte saflaştırılmıştır. Saflaştırılan proteinlerin saflığı, moleküler ağırlığı ve yapısal bütünlüğü SDS-PAGE ve immünoblotlama ile doğrulanmış ve tamamlayıcı biyofiziksel karakterizasyon yöntemleri ile desteklenmiştir. Proteinlerin katlı olduğu sirküler dikroizm ile kontrol edilmiştir. RBD-Fc ile referans ve peptit entegre edilmiş nanokorlar arasındaki etkileşim, doğrudan kompleks oluşumunun doğrulanması amacıyla ilk olarak in vitro pull-down bağlanma deneyi ile değerlendirilmiştir ve proteinlerin çözeltide stabil bir kompleks oluşturabildiği gösterilmiştir. Etkileşim bölgelerini belirlemeyey yönelik gerçekleştirilen peptit haritalama analizleri, peptit entegre edilmiş nanokorlar üzerinde hem entegre edilen peptit dizisini hem de klasik CDR bölgeleri dışında yer alan kanonik olmayan etkileşim bölgelerini ortaya koymuştur. Son olarak Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) ile gerçekleştirilen biyofiziksel karakterizasyon, peptit entegrasyonunun referans nanokora kıyasla bağlanma kinetiklerini ve afinitesini anlamlı şekilde değiştirdiğini ve bağlanmaya katkı sağlayan etkileşimlerin nanokor iskeleti boyunca yeniden dağıldığını göstermiştir. Elde edilen bulgular, nanokor:RBD tanımasının yalnızca statik CDR mimarisiyle değil, peptit mühendisliği yoluyla kazandırılan konformasyonel adaptasyon ile belirlendiğini göstermektedir. Sonuç olarak, RBD tanınmasında CDR3'ün temel rolü göz önüne alındığında, bu bölgeye yapılan peptit eklemelerinin nanokor iskeleti yapısal olarak korunmuş olsa dahi doğal bağlanma mimarisini bozması muhtemeldir. Ayrıca CDR3'te meydana gelen değişikliklerin CDR1 ve CDR2 bölgelerine konformasyonel olarak iletilmesi, RBD ile üretken etkileşimi daha da zayıflatabilir. Bu gözlemler, nanokor-RBD etkileşimlerinin CDR3 mühendisliğine karşı yapısal olarak son derece hassas olduğunu vurgulayan önceki çalışmalarla uyumlu olup, çok işlevli veya peptit entegre edilmiş nanokorların tasarımında CDR3 aracılı kritik temasların korunmasının gerekliliğini ortaya koymaktadır. Moleküler şaperon sistemleri, hem fizyolojik hem de stres koşullarında protein katlanması, yeniden katlanması ve yıkım süreçlerini düzenleyerek protein homeostazının korunmasında merkezi bir rol oynamaktadır. Bu sistemler arasında Hsc70/Hsp70 şaperon sistemi, substratların yeniden katlanma ve proteazomal yıkım arasında yönlendirilmesini koordine ederek protein kalite kontrolünde kilit bir merkez görevi görmektedir. Bag-1, izoform-spesifik etkileşimleri ve ER ile ilişkili yıkım yolaklarındaki rolü aracılığıyla bu ağ içerisinde önemli bir düzenleyici ko-şaperon olarak görev yapmaktadır. Çok fonksiyonlu bir protein olan Bag-1, Hsc70/Hsp70 sistemi ile etkileşerek hücre sağkalımını destekler ve bu etkileşim sırasında ATP'ye bağımlı Hsp70/Hsc70 şaperon döngüsünü modüle eden bir nükleotid değişim faktörü olarak işlev görür. Bag-1, nükleotid değişimini hızlandırarak substratların yeniden katlanmasını baskılar ve şaperon bağlı proteinleri ubiquitin–proteazom aracılı yıkıma yönlendirerek hücresel proteostaza katkı sağlar. Bu nedenle, Bag-1:Hsc70/Hsp70 etkileşiminin ayrıntılı yapısal ve biyofiziksel olarak incelenmesi, proteostaz ve hastalıkla ilişkili protein kalite kontrol mekanizmalarındaki rolünün aydınlatılması açısından büyük önem taşımaktadır. Bu tezin ikinci bölümünde, doğal konformasyonel dinamiklerin korunması ve kanonik BAG:ATPaz arayüzünün ötesine uzanan etkileşim bölgelerinin sistematik olarak tanımlanabilmesi amacıyla tam uzunlukta Bag-1S ve Hsc70 proteinleri kullanılmıştır. Rekombinant Hsc70 ve Bag-1S proteinleri, afinite kromatografisi ile yüksek homojenlikte saflaştırılmış; gerekli durumlarda boyut ayırma kromatografisi gibi ek saflaştırma basamakları uygulanmıştır. Saflaştırılan proteinlerin saflığı, moleküler ağırlığı ve yapısal bütünlüğü SDS-PAGE ve immünoblotlama ile doğrulanmış ve tamamlayıcı biyofiziksel karakterizasyon yöntemleri ile desteklenmiştir. Proteinlerin katlı olduğu sirküler dikroizm ile kontrol edilmiştir. Hsc70 ile Bag-1S arasındaki etkileşim, doğrudan kompleks oluşumunun doğrulanması amacıyla ilk olarak in vitro pull-down bağlanma deneyi ile değerlendirilmiştir ve iki proteinin çözeltide stabil bir kompleks oluşturabildiği gösterilmiştir. Bu ön doğrulamanın ardından, etkileşimin yapısal temellerini ve bağlanma sürecine eşlik eden konformasyonel değişimleri daha ayrıntılı biçimde incelemek amacıyla hidrojen-deuteryum değişim kütle spektrometrisi (HDX-MS) kullanılmıştır. Bununla birlikte, HDX-MS verileri yalnızca bilinen etkileşim yüzeyleriyle sınırlı kalmamış; Bag-1S proteininin UbL domeni içerisinde daha önce yapısal olarak ayrıntılı biçimde tanımlanmamış ek etkileşim bölgelerinin varlığına işaret eden anlamlı korunum arayüzleri de ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, Bag-1S'in Hsc70 ile etkileşiminin tek bir domen üzerinden gerçekleşmediğini, aksine çoklu ve potansiyel olarak geçici temas noktaları içeren daha geniş bir arayüze yayıldığını düşündürmektedir. HDX-MS'e tamamlayıcı bir yöntem olarak uygulanan peptit haritalama analizlerinde de hem kanonik BAG domeni hem de UbL domeni üzerinde örtüşen etkileşim bölgelerinin saptanması, bu gözlemleri desteklemiştir. Peptit haritalamanın daha sınırlı yapısal çözünürlüğüne rağmen, iki bağımsız yaklaşımın benzer bölgeleri işaret etmesi, tanımlanan temas yüzeylerinin biyolojik anlamlılığını güçlendirmektedir. UbL domeni içerisinde her iki yaklaşım ile de etkileşim arayüzlerinin saptanmış olması, bu çalışmanın ilerleyen aşamaları açısından önemli bir basamağı temsil etmektedir. Buna ek olarak, hem UbL hem de BAG domenleri içerisinde tanımlanan etkileşim arayüzleri, Hsc70:Bag-1S etkileşimlerindeki fonksiyonel önemlerinin doğrulanması amacıyla hedefe yönelik mutasyonlar oluşturularak ileri düzeyde test edilecektir. Bu bulgular, söz konusu şaperon-kofaktör sistemine ilişkin mevcut anlayışı genişletmekte ve bu etkileşimin dinamik ve çok boyutlu doğasını vurgulamaktadır.

Özet (Çeviri)

The entry mechanism of SARS-CoV-2 into host cells is based on the highly specific interaction between RBD on the viral Spike protein and the ACE2 receptor located on the host cell surface. This protein-protein interaction plays a critical role in initiating infection by triggering viral membrane fusion. Therefore, inhibitor strategies that directly target the RBD–ACE2 interaction stand out as an important research area in antiviral approaches. Nanobodies, which are single-domain antibodies, are considered promising molecules for blocking viral entry mechanisms due to their small size, high stability, and ability to bind to difficult-to-access epitopes. The first chapter of this thesis focuses on the rational engineering, bacterial expression, and purification of peptide-integrated nanobodies targeting RBD, with an emphasis on how redesigning nanobodies affects conformation and binding mechanisms. Peptide sequences derived from the ACE2:RBD interaction interface were integrated into the CDR3 region of the Ty1 nanobody to directly interfere with the RBD:ACE2 binding surface. This structural modification was designed to increase the affinity of the canonical β-sheet–dominated nanobody. Biophysical characterization using SPR demonstrated that peptide integration significantly altered binding kinetics and affinity compared to the reference nanobody, indicating a redistribution of binding contributions across the nanobody scaffold. Complementary peptide mapping analysis identified distinct interaction regions on the peptide-integrated nanobodies, including both the inserted peptide sequence and non-canonical regions located outside the classical CDR loops. Collectively, the results indicate that nanobody:RBD recognition is governed not only by static CDR architecture but by conformational adaptability introduced through peptide engineering. Molecular chaperone systems play a central role in maintaining protein homeostasis by regulating protein folding, refolding, and degradation under both physiological and stress conditions. Among these systems, the Hsc70/Hsp70 chaperone system serves as a key hub in protein-quality system by coordinating substrate triage decisions between refolding and proteasomal degradation. Bag-1 functions as an important regulatory co-chaperone within this network through its isoform-specific interactions and involvement in ER-associated degradation pathways. As a multifunctional protein, Bag-1 promotes cell survival by interacting with the Hsc70/Hsp70 system, where it acts as a nucleotide-exchange factor that modulates the ATP-dependent Hsp70/Hsc70 chaperone cycle. By accelerating nucleotide exchange, Bag-1 suppresses substrate refolding and biases chaperone-bound clients toward ubiquitin–proteasome–mediated degradation, thereby contributing to cellular proteostasis. Therefore, detailed structural and biophysical investigation of the Bag-1:Hsc70/Hsp70 interaction is essential for elucidating its function in proteostasis and disease-related protein quality control mechanism pathways. In the second part of this thesis, full-length Bag-1S and Hsc70 proteins were employed to preserve native conformational dynamics and to enable the systematic identification of interaction regions that extend beyond the canonical BAG:ATPase interface. Recombinant Hsc70 and Bag-1S proteins were purified to high homogeneity using affinity chromatography, followed by additional purification steps, including size-exclusion chromatography when required. Protein purity, molecular weight, and structural integrity were verified by SDS-PAGE and immunoblotting, supported by complementary biophysical characterization. The interaction between Hsc70 and Bag-1S was first assessed using an in vitro pull-down binding assay to confirm direct complex formation. Upon verification of the interaction, HDX-MS was employed to resolve the interaction interfaces at higher structural resolution and to capture solution-state conformational dynamics. Consistent with previous studies, HDX-MS revealed protection patterns corresponding to the canonical BAG:ATPase domain interface. Importantly, additional interaction regions were identified within the UbL domain of Bag-1S, indicating the presence of extended or alternative contact sites. As complementary assay to HDX-MS, common interaction interfaces were identified by peptide mapping. These findings suggest that the Hsc70:Bag-1S interaction is not restricted to a single static interface but involves a distributed interaction network that may fine-tune chaperone cycle regulation and Bag-1S–mediated protein quality control.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    923256

    Development and characterization of affinity-maturated nanobodies targeting B-lymphocyte antigen CD19

    B-lenfosit antijeni hedefleyen afinitesi artırılmıs nanokorların geliştirilmesi ve karakterizasyonu

    GHAZI AL ALI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Genetikİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞERİFE AYAZ GÜNER

  2. Tez No

    397980

    Fabrication of vanadium and niobium borides via milling-assisted solid state synthesis methods and sintering techniques

    Vanadyum ve niyobyum borürlerin öğütme destekli katı hal sentezleme yöntemleri ve sinterleme teknikleri ile üretimi

    ÖZGE BALCI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Metalurji Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Bölümü

    PROF. DR. İSMAİL DUMAN

  3. Tez No

    472850

    Characteristics of cold sprayed titanium based coatings

    Soğuk gaz dinamik püskürtme yöntemiyle üretilmiş titanyum esaslı kaplamaların karakteristiği

    AHMET HİLMİ PAKSOY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Mühendislik Bilimleriİstanbul Teknik Üniversitesi

    Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MURAT BAYDOĞAN

    DOÇ. DR. ERDEM ATAR

  4. Tez No

    688848

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EVRİM KAPUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  5. Tez No

    350650

    Ni/ZnO nanokompozit partiküllerinin ultrasonik sprey piroliz tekniğiyle üretimi

    Production of Ni/ZnO nanocomposite particles via ultrasonic spray pyrolysis (USP) method

    İLAYDA KOÇ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    Metalurji Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEBAHATTİN GÜRMEN

Geri Dön