Epigenome-targeted CRISPR screen reveals stage-specific dependencies in human erythropoiesis
CRISPR taraması ile eritropoezde farklılaşma aşamasına özgün epigenetik faktörlerin belirlenmesi
- Tez No: 1002469
- Danışmanlar: PROF. DR. ÖZLEM YALÇIN SEYHAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Hematoloji, Genetics, Hematology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Eritropoez, farklılaşmanın belirli hücresel evreler boyunca ilerlediği ve terminal olgunlaşma ile enükleasyonla sonuçlanan, sıkı biçimde düzenlenen bir süreçtir. Soy belirleyici transkripsiyon faktörleri eritroid gen düzenlenmesi için vazgeçilmez olsa da, epigenetik düzenleyicilerin eritroid olgunlaşma sırasında hücre evresine özgü transkripsiyonel programları nasıl yönlendirdiği hâlâ yeterince anlaşılmamıştır. Bu tez çalışmasında, insan eritropoezinin epigenetik düzenleyici yapısı CRISPR/Cas9 tabanlı fonksiyonel taramalar kullanılarak sistematik biçimde incelenmiştir. Çalışmalar, eritroid farklılaşmada merkezi rol oynayan iki temel kromatin düzenleyici yolak ortaya koymuştur: histon asetiltransferaz EP300 ve SMARCB1 içeren cBAF (SWI/SNF) kromatin yeniden düzenleme kompleksi. BEL-A hücreleri ve primer CD34⁺ progenitörler dahil olmak üzere senkronize insan eritroid farklılaşma modelleri kullanılarak, EP300 ve SMARCB1'in eritropoezi birbirinden farklı ve hücre evresine bağlı mekanizmalarla düzenlediği gösterilmiştir. EP300'ün eritroid farklılaşmanın erken aşamalarında gerekli olduğu gösterilmiştir. EP300 kaybı, erken eritroid evre geçişlerini bozarak eritroid genlerin geniş ölçekte aktive edilememesine ve eritroid soya yönelimin zayıflamasına yol açmaktadır. Buna karşılık, SMARCB1 erken eritroid farklılaşma için daha az kritik olmakla birlikte, terminal olgunlaşma aşamasında vazgeçilmez hâle gelmektedir. Primer CD34⁺ hematopoietik kök/progenitör hücrelerde EP300 kaybı bazofilik–polikromatik geçişte ilerlemeyi durdururken, SMARCB1 eksikliği eritrosit üretimini ve enükleasyon verimliliğini belirgin biçimde azaltmıştır. Ayrıca, tek hücreli ve toplu RNA dizileme analizleri, EP300'ün farklılaşmaya eşlik eden transkripsiyonel programları yönettiğini doğrulamıştır. SMARCB1'in terminal eritropoezdeki rolünü daha iyi anlamak amacıyla genom genelinde kromatin erişilebilirliği incelenmiş ve SMARCB1 kaybının global kromatin erişilebilirliğini değiştirmediği görülmüştür. Benzer şekilde, SMARCB1 perturbasyonunun GATA1 protein düzeylerini etkilemediği saptanmıştır. Bu bulgular, SMARCB1'in eritroid olgunlaşmayı kromatin erişilebilirliği ya da transkripsiyon faktörü ekspresyonundaki değişiklikler yoluyla düzenlemediğini göstermektedir. SMARCB1'e bağlı eritroid transkripsiyonel programların temelindeki protein–DNA etkileşimlerini incelemek için, kromatin üzerinde transkripsiyon faktörü bağlanmasını yüksek çözünürlükte haritalamaya olanak tanıyan, deaminaz temelli bir footprinting yöntemi olan Docking & Deamination-Seq (D&D-Seq) kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar, SMARCB1 knockout'unun eritroid düzenleyici bölgelerin bir kısmında GATA1 bağlanmasını değiştirdiğini; özellikle SNCA lokusunda bağlanmanın azaldığını, TFR2 lokusunda ise arttığını göstermiştir. SNCA'nın normal geç evre eritroid farklılaşma sırasında güçlü biçimde aktive edildiği göz önüne alındığında, bu bulgular SMARCB1'in terminal olgunlaşma gen programlarının GATA1 aracılığıyla doğru şekilde aktive edilmesi için gerekli olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak bu çalışma, EP300'ü erken eritroid farklılaşma için gerekli bir faktör, SMARCB1/cBAF kompleksini ise terminal olgunlaşma ve enükleasyon için kritik bir bağımlılık olarak tanımlamakta ve insan eritropoezinin ardışık evrelerini koordine eden, birbirinden farklı kromatin temelli mekanizmaları ortaya koymaktadır.
Özet (Çeviri)
Erythropoiesis is a tightly regulated differentiation process that proceeds through discrete cellular states and culminates in terminal maturation and enucleation. While lineage-defining transcription factors are essential to erythroid gene regulation, including the master erythroid transcription factor GATA1, the mechanism of how epigenetic regulators shape cell state–specific transcriptional programs during erythroid maturation remains poorly understood. In this thesis, we systematically interrogated the epigenetic regulatory landscape of human erythropoiesis through CRISPR/Cas9-based functional screens. This work revealed two principal chromatin regulatory pathways that play central roles in erythroid differentiation: the histone acetyltransferase EP300 and the SMARCB1-containing cBAF (SWI/SNF) chromatin remodeling complex. Using synchronized human erythroid differentiation models, including BEL-A cells and primary CD34⁺ progenitors, we demonstrate that EP300 and SMARCB1 regulate erythropoiesis through distinct, cell state–dependent mechanisms. We show that EP300 is required at early stages of erythroid differentiation. Loss of EP300 disrupts early erythroid cell state transitions, leading to a broad failure in erythroid gene induction and impaired commitment to the erythroid lineage. In contrast, SMARCB1 is essential during terminal maturation. In primary CD34⁺ hematopoietic stem/progenitor cells, EP300 loss blocked progression at the basophilic–polychromatic transition, while SMARCB1 deficiency significantly reduced erythrocyte output and enucleation efficiency. Furthermore, using single-cell and bulk RNA sequencing, we further validated that EP300 governs differentiation-associated transcriptional programs. To understand the role of SMARCB1 in terminal erythropoiesis, we assessed chromatin accessibility across the genome and found that SMARCB1 loss does not alter global chromatin accessibility. We also found that GATA1 protein expression does not change with SMARCB1 perturbation. These findings indicated that SMARCB1 does not regulate erythroid maturation through changes in chromatin accessibility or transcription factor expression. To investigate the protein–DNA interactions underlying SMARCB1-dependent erythroid transcriptional programs, we performed Docking & Deamination-Seq (D&D-Seq), a deaminase-based footprinting approach that enables high-resolution mapping of transcription factor occupancy on chromatin. The results indicated that SMARCB1 knockout alters GATA1 occupancy at a subset of erythroid regulatory loci, including reduced binding at the SNCA locus and increased binding at TFR2. As SNCA is robustly induced during normal late-stage erythroid differentiation, these results demonstrate that SMARCB1 is required for proper GATA1-mediated activation of terminal maturation gene programs. Together, these findings establish EP300 as an early differentiation dependency and SMARCB1/cBAF as a late enucleation dependency, uncovering distinct chromatin-based mechanisms that coordinate sequential stages of human erythropoiesis.
Benzer Tezler
- Identification of epigenetic factors that will overcome therapy resistance in triple-negative breast cancer
Üçlü negatif meme kanserinde tedavi direncini kırabilecek epigenetik faktörlerin belirlenmesi
ÖZLEM YEDİER BAYRAM
Doktora
İngilizce
2022
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TUĞBA BAĞCI ÖNDER
- Optimization of epigenome-wide CRISPR-CAS9 knockout screen analysis to prioritize cancer therapeutics
Kanser tedavilerine öncelik vermek için epigenom genelinde crispr-CAS9 tekniğinin analizinin optimizasyonu
EZGİ KURT
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyolojiKoç ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TUĞBA BAĞCI ÖNDER
DR. ÖĞR. ÜYESİ HAMZAH SYED
- The molecular mechanism of BRPF proteins for the reversion of taxane resistance in prostate cancer
BRPF proteinlerinin prostat kanserinde taksan direncini geri çevirmedeki moleküler mekanizması
BEYZA DEDEOĞLU AYDIN
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
- IRF4-driven epigenetic changes in melanoma cells: Understanding downstream effects for targeted therapy
Melanom hücrelerinde IRF4'ün yönettiği epigenetik değişiklikler: Yeni hedefli tedaviler için alt yolakların incelenmesi
ULDUZ SOBHI AFSHAR
Doktora
İngilizce
2023
GenetikBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NEŞET CEVDET TOLGA EMRE
- Lifestyle factors, medications and colon cancer survival stratified by biomarkers: a molecular cancer epidemiology approach
Biyobelirteçlere göre sınıflandırılmış yaşam tarzı faktörleri, ilaçlar ve kolon kanseri sağkalımı: Moleküler kanser epidemiyolojisi yaklaşımı
YASEMİN ADALI
Doktora
İngilizce
2022
Halk SağlığıQueen's Unıversıty BelfastHalk Sağlığı Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HELEN COLEMAN
DR. PHİLİP D. DUNNE