Pichia pastoris maya ekspresyon sisteminde Varicellovirus bovinealpha-1 glikoprotein E'nin rekombinant olarak üretimi
Recombinant production of Varicellovirus bovinealphla-1 glycoprotein E in the Pichia pastoris yeast expression system
- Tez No: 1003314
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AYŞE GENÇAY GÖKSU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Veteriner Hekimliği, Veterinary Medicine
- Anahtar Kelimeler: E glikoproteini, Pichia pastoris, Rekombinant Ekspresyon, Varicellovirus bovinealpha1, E glycoprotein, Pichia pastoris, Recombinant Expression, Varicellovirus bovinealpha1
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Erciyes Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Veterinerlik Mikrobiyolojisi Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Varicellovirus bovinealpha1 (BoAHV-1), sığırlarda solunum ve genital sistem hastalıklarına neden olan, süt üretiminde azalma ve abortlar dahil olmak üzere ciddi ekonomik kayıplara yol açan bulaşıcı bir virus ajanıdır. Glikoprotein E, herpesvirusların immun tepkilerinden kaçmasını ve özellikle sinir dokusu içinde hücreden hücreye verimli bir şekilde yayılmasını sağlayan önemli bir virülans faktörüdür. Bu çalışmada amaç, Pichia pastoris kullanılarak bir maya ekspresyon sisteminde gE glikoproteinini üretmek ve karakterize etmektir. BoAHV-1 izolatı (Kayseri, 2024), MDBK hücre hattında çoğaltılmıştır. Antijenik olarak zengin epitop bölgeleri içeren 210 amino asidi kodlayan kısmi gE gen bölgesi, primerler kullanılarak PCR ile çoğaltıldı. Primerlerin 5' uçlarına, pPICZαA vektöründe bulunan EcoRI ve XbaI kısıtlama enzim bölgeleri eklendi. Elde edilen PCR ürünü, T4 DNA ligaz enzimi kullanılarak vektöre bağlandı ve rekombinant pPICZAα-gE oluşturuldu. Rekombinant plazmid, Escherichia coli DH5α hücrelerinde çoğaltıldı ve saflaştırıldı. Ardından elektroporasyon yoluyla Pichia pastoris GS115'e aktarıldı. Dönüştürülen hücrelerin seçimi, Zeosin antibiyotiği içeren seçici YPD-Sorbitol ortamında gerçekleştirildi. Pozitif kolonilerin zenginleştirilmesinin ardından indüksiyon 96 saat boyunca %1 metanol ile yapıldı. Kültür süpernatantında salgılanan gE, His-etiket affinite reçinesi ile saflaştırıldı. Saflaştırma sonrası protein konsantrasyonu 1,25 mg/mL olarak tespit edildi. SDS-PAGE analizinde yaklaşık 35 kDa moleküler ağırlığa sahip bir proteinin varlığı gözlemlendi ve spesifik ürün, HRP konjugeli 6x-His Tag monoklonal antikoru kullanılarak Western blot analizi ile doğrulandı. Sonuç olarak, protein ekspresyonu için Pichia pastoris sisteminde gE başarıyla ifade edildi ve bu sistemin viral glikoproteinlerin rekombinant üretimi için uygun bir model olarak hizmet edebileceği gösterildi. Elde edilen proteinin ileri tanı ve immünolojik araştırmalarda kullanılabileceği değerlendirildi.
Özet (Çeviri)
Varicellovirus bovinealpha1 (BoAHV-1) is an infectious viral agent that causes respiratory and genital system diseases in cattle, leading to serious economic losses, including decreased milk production and abortions. Glycoprotein E is a key virulence factor that allows herpesviruses to evade immune responses and spread efficiently from cell to cell, particularly within nervous tissue. The aim of this study is to produce and characterize the gE glycoprotein in a yeast expression system using Pichia pastoris. The BoAHV-1 isolate (Kayseri, 2024) was amplified in the MDBK cell line. The partial gE gene region encoding 210 amino acids containing antigenically rich epitope regions was amplified by PCR using primers. EcoRI and XbaI restriction enzyme sites, present in the pPICZαA vector, were added to the 5' ends of the primers. The resulting PCR product was bound to the vector using the T4 DNA ligase enzyme, and recombinant pPICZAα-gE was formed. Recombinant plasmid was amplified and purified in Escherichia coli DH5α cells. It was then transferred to Pichia pastoris GS115 via electroporation. Selection of transformed cells was performed in selective YPD-Sorbitol medium containing the antibiotic Zeocin. Following enrichment of positive colonies, induction was performed for 96 hours with 1% methanol. gE secreted in the culture supernatant was purified using His-tag affinity resin. The protein concentration after purification was determined to be 1.25 mg/mL. SDS-PAGE analysis revealed the presence of a protein with a molecular weight of approximately 35 kDa, and the specific product was confirmed by Western blot analysis using HRP-conjugated 6x-His Tag monoclonal antibody. In conclusion, gE was successfully expressed in the Pichia pastoris system, demonstrating that this system can serve as a suitable model for the recombinant production of viral glycoproteins. The obtained protein was evaluated for its potential use in advanced diagnostic and immunological research.
Benzer Tezler
- Caretta caretta kaynaklı defensin benzeri TEWP peptidi ve analoglarının Pichia pastoris ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi
Recombinant production of TEWP defensin-like peptide from Caretta caretta and its analogues in Pichia pastoris expression system
SAİME GÜLSÜM BATMAN
Doktora
Türkçe
2023
MikrobiyolojiErciyes ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
- De novo antimikrobiyal peptidlerin tasarımı, Pichia pastoris (Komagetaella phafii) ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi ve aktivitelerinin belirlenmesi
Design of de novo antimicrobial peptides, recombinant production in the expression system of Pichia pastoris (Komagetaella phafii) and determination of their activities
ŞEYMA AYDIN
Doktora
Türkçe
2023
BiyoteknolojiErciyes ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
- Hematopoetik hücrelerin üretilmesi, çoğaltılması ve farklılaşmasında görevli epo ve tpo'nun medikal biyoteknolojik ürün olarak üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Production, propagation and differentiation of hematopoetic cells producing, purification and characterization of epo and tpo as medical biotechnological product
DUYGU DÜZGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ SEÇİL ERDEN TAYHAN
- Expression and purification of Arabidopsis thaliana heterotrimeric G protein alpha subunit (GPA1) using bacteria and yeast systems
A.Thaliana G-proteini alfa altbirimi (GPA1)' ın bakteri ve maya sistemlerinde ekspresyonu ve saflaştırılması
HAZAL BÜŞRA KÖSE
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
BiyokimyaSabancı ÜniversitesiBiyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEHRA SAYERS
- Antifungal peptid tasarimi ve rekombinant olarak üretimi
Antifungal peptide design and recombinant production
DİLARA HERDEM
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Gıda MühendisliğiErciyes ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜLAL KESMEN