Functional capabilities of lentiviral motor neuron-specific promoter driven SMN1 gene expression and SMN2 gene editing strategy using crispr-prime editing
Motor nöron-spesifik promotör kontrollü lentiviral smn1 gen ekspresyonunun ve crıspr-prime editing kullanılarak smn2 gen düzenleme stratejisinin fonksiyonel kapasiteleri
- Tez No: 1005509
- Danışmanlar: DOÇ. DR. CİHAN TAŞTAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Biyoloji, Genetics, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Üsküdar Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Spinal müsküler atrofi (SMA), omurilik motor nöronlarının ilerleyici dejenerasyonu ile karakterize edilen, kas güçsüzlüğü, felç ve en ağır vakalarda erken ölümle sonuçlanan ciddi bir otozomal resesif nöromüsküler hastalıktır. SMA'nın genetik temeli, SMN1 geninin homozigot delesyonu veya mutasyonudur. Bu gen, motor nöronların hayatta kalması ve RNA işlenmesi için kritik bir rol oynayan“survival motor neuron”(SMN) proteinini kodlar. Paralel bir gen olan SMN2, SMN1 kaybını kısmen telafi edebilse de, 7. ekzonunda bulunan sessiz bir mutasyon (C840T), çoğunlukla bu ekzonun atlanmasına neden olur ve sonuç olarak kısa ömürlü, kararsız bir SMN proteini sentezlenir. SMA hastalığının şiddeti SMN2 kopya sayısıyla ilişkilidir; ancak hafif formlarda bile yeterli düzeyde fonksiyonel SMN üretilemez. Bu tez çalışması, SMA için iki gelişmiş terapötik stratejinin karşılaştırmalı bir değerlendirmesini sunmaktadır: (1) çeşitli yaygın (EF1α, sCMV, PGK) ve motor nöronlara özgü (SYN) promotörler aracılığıyla lentiviral SMN1 gen ekspresyonu ve (2) SMN2 geninin CRISPR-Prime Editing (CRISPR-PE) teknolojisi ile düzeltilmesi. Bu düzeltme, 840 T>C ve 859 G>C mutasyonlarını hedefleyen çift pegRNA'lar kullanılarak yapılmış ve 7. ekzonun eklenmesini artırarak tam uzunlukta SMN proteini üretimi amaçlanmıştır. Bu iki yaklaşım farklı hastalık modellerinde test edilmiştir: Lentiviral promotör aracılı SMN1 ekspresyonu hem SMA Tip 1 hem de Tip 2 fibroblast hücre hatlarında değerlendirilmiş, Prime Editing tabanlı SMN2 düzeltmesi ise yalnızca SMA Tip 2 fibroblastlarında uygulanmıştır. Zaman içinde yapılan kapsamlı akış sitometrisi analizleri ile GFP ifadesi (transdüksiyon verimliliği), hücre içi SMN protein seviyeleri ve SSC-A ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ölçülerek hücre morfolojisi ve granülaritesi incelenmiştir. Bulgular, çift pegRNA aracılığıyla gerçekleştirilen Prime Editing yaklaşımının SMA Tip 2 fibroblastlarında endojen SMN ifadesini anlamlı şekilde artırdığını ve bu etkinin 60 güne kadar sürdüğünü göstermiştir. Öte yandan, lentiviral SMN1 ekspresyonu her iki SMA modelinde promotör tipine bağlı olarak değişken sonuçlar vermiş; EF1α ve sCMV promotörleri en güçlü ve en stabil ekspresyonu sağlamıştır. Genel olarak bu karşılaştırmalı çalışma, SMA tedavisinde gen yerleştirme ve gen düzeltme stratejilerinin birbirini tamamlayan potansiyellerini vurgulamakta, hücre tipi, promotör seçimi ve düzenleme bağlamı dikkate alınarak daha etkili terapötik yaklaşımların rasyonel bir şekilde tasarlanmasına katkı sunmaktadır.
Özet (Çeviri)
Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe autosomal recessive neuromuscular disorder characterized by the progressive degeneration of spinal motor neurons, resulting in muscle weakness, paralysis, and, in the most severe cases, early death. The genetic basis of SMA lies in the homozygous deletion or mutation of the SMN1 gene, which encodes the survival motor neuron (SMN) protein—an essential factor in RNA processing and motor neuron survival. Although the paralogous SMN2 gene can partially compensate for the loss of SMN1, a silent mutation (C840T) in exon 7 leads to predominant exon skipping, producing a truncated, unstable protein. The severity of SMA correlates with the copy number of SMN2, but even in milder types, SMN protein levels remain suboptimal. This thesis presents a comparative evaluation of two advanced therapeutic strategies for SMA: (1) lentiviral SMN1 gene delivery driven by various ubiquitous (EF1α, sCMV, PGK) and neuron-specific (SYN) promoters, and (2) CRISPR-Prime Editing (CRISPR-PE) of the SMN2 gene using pegRNAs designed to introduce splicing-corrective point mutations—including c.840T>C, c.841A>C, c.844C>G, c.845A>G, c.874T>C, c.878T>G, and c.888A>G—as well as a targeted intronic deletion, to enhance exon 7 inclusion and promote full-length SMN protein expression. These two approaches were applied to different disease models: lentiviral promoter-driven SMN1 expression was evaluated in both SMA Type 1 and Type 2 fibroblast lines, whereas Prime Editing-based SMN2 correction was exclusively tested in SMA Type 2 fibroblasts. Comprehensive flow cytometry analyses were performed to assess GFP expression (transduction efficiency), intracellular SMN protein levels, and SSC-A mean fluorescence intensity (MFI) to monitor cell morphology and complexity over time. The findings demonstrate that dual pegRNA-mediated Prime Editing significantly increased endogenous SMN expression in SMA Type 2 fibroblasts, with effects sustained up to 60 days. On the other hand, lentiviral SMN1 delivery resulted in variable promoter-specific outcomes across both SMA models, with EF1α and sCMV yielding the most robust and stable expression patterns. Altogether, this comparative study underscores the distinct yet complementary therapeutic potential of gene replacement and genome correction strategies in SMA. By accounting for cell type, promoter specificity, and editing context, the results offer valuable insights into the rational design of future SMA therapies tailored to disease severity and patient-specific molecular profiles.
Benzer Tezler
- Investigating molecular interaction networks of nuclear factor one transcription factors
Nükleer faktör I transkripsyon faktörlerinin moleküler etkileşim ağlarının araştırılması
DİCLE MALAYMAR PİNAR
Doktora
İngilizce
2024
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
DOÇ. DR. MARKKU VARJOSALO
- Computational ınvestigation of endohedral hydrogen storage capabilities in several fullerene molecules (C60, C70, C76 etc.) and single wall carbon nanotubes (SWCNTS), employing semi empirical, ab ınitio electronic structure and density functional theory (DFT) methods
Çeşitli fulleren molekülleri (C60, C70, C76, vb.) ve tek katmanlı karbon nanotüpler (SWCNTS) içerisine hidrojen depolanma kapasitesinin yarı-ampirik, ab initio elektronik yapı yöntemleri ve yoğunluk fonksiyoneli teorisi (DFT) metotlarıyla hesapsal olarak incelenmesi
İrfan Aydoğdu
- Ürün geliştirme takımlarında anlamlandırma(sensemaking) yetenekleri ve proje başarısı ilişkisi
Sensemaking capabilities of cross-functional new product developement teams and their final effects on project success
DERYA DOĞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
İşletmeGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüStrateji Bilimi Bölümü
DOÇ. DR. HALİT KESKİN
- Öğrenme odaklılığın firma performansı üzerindeki etkisinde fonksiyonel yeteneklerin aracılık rolü ve rekabetin yoğunluğunun düzenleyici etkisi
Mediating role of functional capabilities and moderator effect of competitive intensity on the relationship between learning orientation and firm performance
HACER YILDIZ ÖZTÜRK
- LiB nano-yapılarının hidrojen depolama kabiliyetinin yoğunluk fonksiyonel teori yöntemiyle incelenmesi
Density functional theory studies on hydrogen storage capabilities of LiB nano-structures
ALİ ÖZKURT
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
Fizik ve Fizik MühendisliğiKırıkkale ÜniversitesiFizik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ERDEM KAMİL YILDIRIM