Geri Dön

Investigating molecular interaction networks of nuclear factor one transcription factors

Nükleer faktör I transkripsyon faktörlerinin moleküler etkileşim ağlarının araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 915589
  2. Yazar: DİCLE MALAYMAR PİNAR
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR, DOÇ. DR. MARKKU VARJOSALO
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Genetik, Biochemistry, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 178

Özet

Gen ekspresyonu, hücresel işlevlerin sürdürülmesi ve organizmanın sağlıklı gelişimi için son derece titiz bir şekilde düzenlenmektedir. Bu süreçte transkripsiyon faktörleri (TF'ler), hücre içerisindeki genlerin hangi seviyede ve ne zaman aktif olacağını belirleyen ana düzenleyici proteinler olarak önemli bir rol oynar. T'ler, belirli DNA dizilerine bağlanarak hedef genlerin ifadesini kontrol eder. TF'lerin etkinliğinde ve düzenleyici işlevlerinde herhangi bir aksaklık, gelişim bozukluklarından kansere kadar birçok sağlık sorununa yol açabilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında incelenen Nükleer Faktör I (NFI) protein ailesi, hem gelişimsel süreçlerde hem de kanser gibi hastalıklarda önemli roller oynayan bir transkripsiyon faktörü ailesidir. Omurgalılarda dört temel NFI üyesi bulunmaktadır: NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX. NFI genlerinin alternatif kırpılması sonucu çeşitli protein izoformları ortaya çıkmıştır. Tam uzunluktaki NFI proteinleri, oldukça korunmuş bir N-terminal DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesine sahiptir. Bu sayede, genomik DNA'da TTGGC(N5)GCCAA konsensüs motifini tanıyıp hem homodimer hem de heterodimer olarak bağlanabilmektedirler. NFI transkripsiyon faktörleri, hedef gen ekspresyonunu düzenlerken diğer proteinler ve kromatinle etkileşime girerek hücre içinde geniş bir etkileşim ağı oluşturur. Ancak, belirli hücre hatları veya hastalık modellerinde gösterilmiş birkaç spesifik protein etkileşim partneri ve diğer transkripsiyon faktörleriyle etkileşiminin araştırıldığı çalışmalar dışında, NFI ailesine ait etkileşim ağları (interaktomlar), bu ağların dinamik yapıları ve işlevleri henüz tam anlamıyla keşfedilmemiştir. Bu tez çalışmasında, NFI proteinlerinin hücre içi etkileşim partnerlerini ve işlevlerini kapsamlı bir şekilde analiz edebilmek amacıyla modern omik yöntemleri bir arada uygulanmıştır. NFI proteinlerinin etkileşim ağını ayrıntılı olarak ortaya koymak için afinite saflaştırma kütle spektrometrisi (AP-MS) ve yakınlığa bağımlı etiketleme (BioID) gibi etkileşim ağı analizleri yapılmış; bunun yanı sıra, DNA üzerindeki hedef bölgeleri belirlemek amacıyla kromatin immünopresipitasyon dizilemesi (ChIP-Seq) yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışmada, AP-MS ve BioID analizlerinin birlikte yapılmasını sağlayan MAC-tag yaklaşımı uygulanmıştır. MAC3-tag içindeki BioID (UltraID) dizisine ek olarak bulunan HA epitopu, western blot ile ekspresyon tespiti, hücre içi lokalizasyon deneyleri ve ChIP-Seq yönteminde aynı hücre hatlarının kullanımını mümkün kılmıştır. Endojen seviyelere yakın protein ekspresyonu elde edilmesine olanak tanıyan izojenik indüklenebilir Flp-In™ T-REx™ 293 hücre hatlarında MAC-tag yaklaşımının yanı sıra, standart yöntemlerle transfeksiyonu zor olan nöroblastoma ve glioblastoma hücre hatlarında stabil hücre hattı oluşturmak için lentivirüs transdüksiyonu ve transfeksiyonu kolaylaştırmak amacıyla elektroporasyon yöntemleri de kullanılmıştır. NFI ailesinin dört ana üyesi olan NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX'in tam uzunluktaki izoformları ile DNA bağlanma bölgesi bulunmayan ve başlangıçta megakaryosit farklılaşması ile ilişkilendirilen atipik NFIB4 izoformu, bu çalışmada kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Farklı biyotinleme süreleri ile gerçekleştirilen BioID etiketleme yöntemi kullanılarak etkileşim partnerleri belirlenmiş; stabil etkileşimler ise AP-MS analizi ile tespit edilmiştir. Paralel olarak yürütülen ChIP-seq deneyleri, NFI proteinlerinin potansiyel hedef genlerini ortaya çıkarmıştır. Ayrıca, NFIA'nın etkileşimde bulunduğu önemli transkripsiyon faktörlerinden biri olan SOX2 üzerindeki düzenleyici etkisi de araştırılmıştır. Ek olarak, NFI DNA bağlanma bölgesinin yapısını anlamak ve DNA motifi ile nasıl etkileştiğini incelemek amacıyla AlphaFold3 kullanılarak yapılan modelleme analizleri, NFI proteinleri ile ChIP-seq sonuçlarından elde edilen hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimde hangi aminoasitlerin ve hangi yapısal bölgelerin yer aldığını göstermiştir. Yapılan veri filtrelemeleri sonucunda elde edilen etkileşim partnerleri ve hedef gen listeleri, NFI protein ailesi üyeleri arasında belirgin bir örtüşme olduğunu ortaya koymakla birlikte, yalnızca bir üyeye özgü etkileşim partnerleri ve hedef genlerin de bulunduğunu göstermiştir. Farklı biyotinleme zamanlarında elde edilen veriler, NFI proteinlerinin kromatin düzenleyici kompleksler ve transkripsiyonda rol oynayan diğer komplekslerle dinamik ilişkilerini ortaya koymuştur. BioID etiketleme yöntemi ile özellikle SWI/SNF ve Mediator kompleksleriyle olan etkileşimler tespit edilmiştir. SWI/SNF kompleks üyeleri, AP-MS analizinde de saptanmış olup ko-immunopresipitasyon deneyleriyle doğrulanan bu etkileşimler, NFI proteinlerinin SWI/SNF ile olan yakın iş birliğini ve kromatin yeniden düzenlemedeki rollerini vurgulamaktadır. Önceki araştırmalar NFIA ve NFIB'nin Mediator kompleksi ile ilişkisini ortaya koyarken, bu çalışmada NFIC'nin de Mediator ile etkileşimde bulunduğu gözlemlenmiştir; ancak, bu etkileşimler yalnızca proksimite etiketleme ile tespit edilebilmiş olup, AP-MS analizinde Mediator kompleks proteinleri saptanamamıştır. Bu nedenle, NFI-Mediator kompleks protein etkileşimleri geçici veya zayıf etkileşimler olarak değerlendirilmektedir. Özellikle kısa izoform NFIB4'ün etkileşim ağında mRNA düzenlemesi ile ilişkili proteinlerin bulunması, NFI proteinlerinin geleneksel DNA bağlanma ve transkripsiyonel modülasyon işlevlerinin ötesine geçerek post-transkripsiyonel süreçlere de etki edebileceğini düşündürmektedir. AlphaFold3 kullanılarak yapılan yapısal analizler, NFI'ların DNA bağlanma ve dimerleşme bölgesinde DNA ile fiziksel etkileşen dört yapıyı —loop, helix1, helix2 ve segment— ortaya çıkarmıştır. Ek olarak, ChIP-seq sonucunda elde edilen dizilerle ile yapılan tahminler, NFI'ların farklı mesafe uzunluklarına sahip motiflere bağlanabildiğini göstererek bu proteinlerin motif tanımada esnek olduğunu ortaya koymuştur. Bu bağlanma esnekliği, NFI proteinlerinin genomda daha geniş bir düzenleyici etki alanına sahip olabileceği anlamına gelmektedir. ChIP-seq deneylerini RNA interference (RNAi) deneyleriyle birleştirerek yaptığımız çalışmamız, NFIA'nın önemli bir etkileşim partneri olan SOX2 proteininin aktivitesini etkilediğini göstermiştir. NFIA'nın baskılanması, SOX2'nin genom genelindeki bağlanma profilini değiştirmiş ve SOX2 hedef genlerinde dikkate değer değişikliklere yol açmıştır. Özellikle, NFIA baskılanması sonrasında potansiyel SOX2 hedeflerinin yolak analizinde cAMP sinyal yolağıyla ilişkili hedef genlerin ortaya çıktığı gözlemlenmiştir. Bu deney sonuçları, NFI transkripsiyon faktörlerinin diğer transkripsiyon faktörlerini modüle ederek ve çeşitli hücresel süreçlerde birçok proteinle etkileşime girerek“master regülatörler”olarak işlev görebileceğini düşündürmektedir. NFI'lar 'pioneer' özellikler sergiliyor gibi görünse de kapalı kromatine bağlanma yeteneklerinin doğrudan kanıtlanması için ek deneylerin yapılması gerekmektedir. Gelecekteki çalışmalar, NFI'ların nükleozoma bağlı veya erişilemez kromatin bölgelerine erişip erişemediğini belirleyerek, onların pioneer transkripsiyon faktörleri olarak potansiyel rollerini doğrulamaya katkı sağlayabilir. Sonuç olarak, bu tez çalışması, NFI protein ailesinin gen düzenlemesindeki rollerine dair bilgilerimizi genişletirken, hücresel işlevleri etkileyen hem mevcut hem de yeni etkileşimleri ortaya koymaktadır. Modern deneysel yaklaşımlar kullanılarak, her bir NFI üyesi için belirgin etkileşim profilleri ve hedef genler tanımlanmış, böylece transkripsiyonel düzenleme ağlarındaki bireysel rolleri vurgulanmıştır. Özellikle, NFIB4 izoformunun benzersiz etkileşim ağı ve mRNA düzenleyici proteinlerle ilişkisi, NFI'ların geleneksel DNA bağlanma işlevlerinin ötesine geçerek post-transkripsiyonel süreçlere de etki edebileceğini göstermektedir. Ayrıca, NFIA'nın SOX2 bağlanması ve yol zenginleşmesi üzerindeki etkisi, NFI'ların hücresel kader kararları ve farklılaşma süreçlerinde rehberlik edebilecek ana düzenleyiciler olarak potansiyelini ortaya koymaktadır. Bu bulgular, NFI işlevinin kromatin yeniden düzenlenmesi ve gen ekspresyonundaki mekanizmalarının yanı sıra kanser ve nörogelişimsel bozukluklar gibi hastalıklarda terapötik uygulamalarını incelemeyi amaçlayan gelecekteki araştırmalar için sağlam bir temel oluşturmaktadır.

Özet (Çeviri)

Gene expression is a tightly regulated process involving multiple steps, with transcription factors (TFs) serving as key regulators. TFs bind to specific DNA sequences, interact with other proteins, and modulate the expression of target genes. Among these, the Nuclear Factor I (NFI) family plays a significant role in development and cancer. NFI transcription factors are key regulators of gene expression, influencing cellular proliferation, differentiation, and specialization across various tissues. In vertebrates, the NFI family includes four members: NFIA, NFIB, NFIC, and NFIX. Alternative splicing of NFI genes gives rise to multiple isoforms. These proteins contain a highly conserved N-terminal DNA-binding and dimerization domain, enabling them to recognize and bind a consensus sequence (TTGGC(N5)GCCAA) as either homo- or heterodimers. While performing their regulatory functions, NFI family members interact with other proteins and the chromatin. However, aside from a few specific interactions detected in certain contexts and the interactions of NFIs with other transcription factors, the interactomes of NFIs, their dynamics, and their functions remain largely unexplored. In this thesis, we employed complementary omics-level techniques, i.e., interactomics (affinity purification mass spectrometry (AP-MS) and proximity-dependent biotinylation (BioID)), and chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq), to obtain a comprehensive view of the NFI proteins and their interactions. The MAC-tag approach was utilized, enabling combined AP-MS and BioID analyses. The HA epitope within the MAC3-tag, along with the BioID (UltraID) sequence, allows detection of tagged protein expression by immunoblotting and immunofluorescence, and the use of the same Flp-In™ T-REx™ 293 cell lines in ChIP-Seq for studying protein-DNA interactions. In addition to the MAC-tag approach in isogenic inducible Flp-In™ T-REx™ 293 cell lines, we utilized lentivirus transduction and electroporation methods to achieve forced expression in neuroblastoma and glioblastoma cell lines, which are generally difficult to transfect using standard methods. Our experimental approach encompassed all four predominant isoforms of NFI family members and the atypical isoform NFIB4, which lacks the DNA-binding domain and was initially linked to megakaryocyte differentiation. Interaction partners were identified through proximity labeling with varying biotinylation times, while stable interactors were captured using AP-MS analysis. In parallel, ChIP-seq experiments were performed to uncover potential NFI target genes. We also investigated NFIA's regulatory impact on one of its interacting partners, the transcription factor SOX2. Additionally, we used AlphaFold 3 to predict DNA binding, modeling interactions between NFI proteins and their ChIP-seq target DNA sequences, enabling us to identify key regions of the NFI proteins involved in DNA binding. We observed that, despite exhibiting some redundancy, each family member had unique high-confidence interactors and target genes, highlighting distinct roles within the transcriptional regulatory networks. Time-dependent interactome mapping revealed the dynamic nature of NFI interactions with chromatin remodelling and transcriptional regulator complexes. UltraID-based proximity labeling identified extensive, evolving interactions with chromatin remodeling and transcriptional complexes, particularly SWI/SNF and Mediator. AP-MS confirmed stable associations with SWI/SNF complex proteins, and most of the interactors are validated by co-expression and pull down experiments, underscoring the collaborative roles of NFIs and SWI/SNF in chromatin remodeling. While previous studies associated NFIA and NFIB with the Mediator complex in neural stem cells, our findings reveal that NFIC also interacts with Mediator complex; however, these associations appear transient or context-dependent and are only detected by proximity labeling. The interactome of the atypical short isoform, NFIB4, is enriched with proteins involved in mRNA regulation, suggesting that NFIs may have roles beyond traditional DNA binding and transcriptional modulation. Meanwhile, structural analysis using AlphaFold3 revealed four conserved binding regions—loop, helix1, helix2, and segment—that are critical for DNA interaction. Additionally, predictions with ChIP-seq results showed that NFIs can bind to motifs with variable spacer lengths, indicating flexibility in motif recognition. By integrating ChIP-seq with RNA interference (RNAi) experiments, our study identified SOX2 as an important target of NFIA. NFIA knockdown led to an altered genomic binding profile of SOX2, accompanied by notable shifts in pathway enrichment among SOX2 target genes. Specifically, pathway analysis of potential SOX2 targets post-NFIA silencing revealed enrichment in the cAMP signaling pathway. Our findings reveal that NFIs interact with a diverse array of chromatin remodelers, transcriptional regulators, and other proteins, highlighting their extensive roles in regulating gene expression. Time-resolved interactomics demonstrated dynamic and context-dependent interactions with key complexes, such as SWI/SNF and Mediator, suggesting that NFIs actively participate in coordinating transcriptional activity. Additionally, integration of ChIP-seq data with RNA interference experiments showed that NFIA modulates the activity of other transcription factors, including SOX2, altering its genomic binding profile and influencing pathway enrichment among its target genes. These observations, coupled with the isoform-specific interaction profiles and their distinct sets of target genes, position NFIs as central regulators capable of modulating complex transcriptional networks and influencing cellular processes across diverse contexts. Therefore, we propose that NFIs function as master regulators, modulating other transcription factors and interacting with various proteins across multiple cellular processes. While NFIs may exhibit pioneering capabilities, this requires validation through direct evidence of their ability to bind closed chromatin. Future studies could determine whether NFIs access nucleosome-occupied or otherwise inaccessible chromatin, helping to confirm their potential role as pioneering transcription factors. In conclusion, this thesis advances our understanding of the NFI family's roles in gene regulation, revealing both established and novel interactions that shape cellular function across various contexts. By employing complementary omics-level approaches, we identified distinct interaction profiles and target genes for each NFI member, underscoring their individual roles within transcriptional regulatory networks. The unique interactome of the NFIB4 isoform, particularly its association with mRNA regulatory proteins, suggests a broader functional scope for NFIs that may extend beyond traditional DNA binding to influence post-transcriptional processes. Additionally, our findings on NFIA's regulatory effects over SOX2 binding and pathway enrichment point to NFIs as master regulators with the potential to guide cellular fate decisions and differentiation. These insights lay the groundwork for future research aimed at exploring the mechanisms of NFI function in chromatin remodeling and gene expression, as well as their therapeutic implications in diseases such as cancer and neurodevelopmental disorders.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    768603

    Investigating the role of nuclear receptor enhancers on gene transcription

    Başlık çevirisi yok

    UMUT BERKAY ALTINTAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyoistatistikKoç Üniversitesi

    Hesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NATHAN ALLAN LACK

  2. Tez No

    730195

    Investigation of the effect of valproic acid, an hdac inhibitor, on the relationship between oxidative stress and autophagy in human eosinophil

    İnsan eosinofillerinde valproik asit ile oluşturulan oksidatif stres ve otofaji sonrası bağışık yanıtların incelenmesi

    GÖKSU ÜZEL TURAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI

  3. Tez No

    853372

    Investigation of mechanoregulatory role of desmin protein

    Investigation of mechanoregulatory role of desmin protein

    NİLÜFER DÜZ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Tıbbi BiyolojiHacettepe Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PERVİN RUKİYE DİNÇER

  4. Tez No

    467227

    Dikey dalan sıvı jeti için farklı jet çıkış geometrilerinin havalandırma miktarına etkisinin sayısal olarak incelenmesi

    Investigation of the different nozzle geometries for vertical plunging water jet air entrainment with numerical methods

    BURAK ALP KARAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Maden Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YAKUP ERHAN BÖKE

    DR. ZAFER GEMİCİ

  5. Tez No

    401188

    Investigation of the higher order structure of the spliceosomal RNA network

    Başlık çevirisi yok

    GİZEM DÖNMEZ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    Tıbbi BiyolojiGeorg-August-Universität Göttingen

    PROF. DR. RALF FICNER

    PROF. DR. REINHARD JAHN

Geri Dön