PA, EF ve LF antijenlerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of PA, EF and LF
- Tez No: 1006497
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ SONAY ÖZKAN, DR. DUYGU AYDIN TEKDAŞ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bacillus anthracis, Şarbona sebep olan Gram (+) ve fakültatif anaerob bir bakteridir ve bilinen iki virülans faktörüne sahiptir: bir tripartite toksini ve bir poli-D glutamik asit kapsülü. Üçlü toksin, koruyucu antijen (PA; MW 83 kDa, pl 5.6), letal faktör (LF; MW 90 kDa, pI 5.4) ve ödem faktörü (EF; MW 89 kDa, pI 6.5) içerir. PA ve LF proteinlerinin bir araya gelmesiyle LT (ölümcül toksin), PA ve EF proteinlerinin bir araya gelmesiyle ET (ödem toksin) oluşmaktadır. Bu toksinler, şarbon hastalığının ilerlemesi ve yayılmasında kritik öneme sahiptir. B. anthracis'e ait bilinen toksin bileşenlerinin üretimi, ayrılması ve saflaştırılması için geliştirilmiş birçok yöntem mevcuttur. Toksin aktivitesinin daha iyi anlaşılması, hastalığa karşı korumada tek tek bileşenlerin rolü ve teşhis sistemlerinde kullanılmak üzere antijenlerin üretimi, şimdiye kadar elde edilenden daha yüksek saflık derecelerini gerektirmektedir. Bu tez kapsamında, toksinlerin saflaştırılmasında kullanılan yöntemler, üretim aşamasında ortaya çıkan safsızlıkları uzaklaştırma işlemini optimize etmek için ampirik olarak dizayn edilmiştir. Tezin ilk aşamasında, B. anthracis'in iki farklı besiyerindeki büyüme eğrisi, PA, LF ve EF proteinlerinin üretimi ve spor oluşumu için en uygun besiyerleri belirlenmiş, üretilen proteinlerin konsantre edilme yönteminin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Konsantre edilen proteinlerin saflaştırma işlemleri için Anyon Değişimi Kromatografisi, Jel Filtrasyon Kromatografisi ve Hidrofobik Etkileşimler Kromatografisi yöntemleri uygulanmış ve her bir yöntem optimize edilmiştir. Tezin ikinci aşamasında ise rekombinant yöntemlerle E. coli'de üretimi yapılan PA proteininin Afinite Kromatografisi, Anyon Değişimi Kromatografisi ve Jel Filtrasyon Kromatografisi yöntemleriyle saflaştırılmasının optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Böylece konvansiyonel ve rekombinant yöntemler ile üretilen PA toksininin saflaştırılma sonuçları karşılaştırılmalı olarak incelenmiştir. Saflaştırılan örneklerin saflık derecesi ve miktarı Gümüş Boyama ve Western-Blot ve Bradford Assay yöntemleriyle doğrulanmıştır. 3 aşamalı saflaştırma protokolü sonrasında rPA %95 saflıkta ve yüksek miktarda elde edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Bacillus anthracis, is a gram (+) facultative anaerobic bacteria which causes the Anthrax and has two known virulence factors: a tripartite protein toxin and a poly-D-glutamic acid capsule. The tripartite toxin consists of protective antigen (PA; MW 83 kDa, pl 5.6), lethal factor (LF; MW 90 kDa, pI 5.4) and edema factor (EF; Mr 89 kDa, pI 6.5). Combination of PA and LF forms LT (lethal toxin) and combination of PA and EF forms ET (edema toxin). These toxins are critical in the progression and spread of anthrax disease. There are many methods developed for the production, separation and purification of known toxin components of B. anthracis. Higher degrees of purity are required for better knowledge of toxin activity, the role of individual components in disease defense, and the development of antigens for use in diagnostic systems than have previously been accomplished. Within the scope this thesis, downstream purification processes for the three toxins are designed based on a platform process that is empirically tuned to optimize impurity removal for each new product. In the first part of this thesis, we determined the growth curve of B. anthracis in two different media, optimum conditions for toxin production and the most suitable media required for spore formation. In addition, the optimization of the concentration method of the produced proteins was carried out. Anion Exchange Chromatography, Gel Filtration Chromatography and Hydrophobic Interactions Chromatography methods were applied for the purification of the concentrated proteins and each method was optimized. In the second part of this thesis, Affinity Chromatography, Anion Exchange Chromatography, and Gel Filtration Chromatography methods were used to optimize the purification of the PA protein, which is also produced in E. coli via recombinant methods. Purified samples's purity and quantity were verified by Silver Staining, Western-Blot and Bradford Assay methods. After 3 staged purification protocol, %95 pure rPA was obtained in high quantity.
Benzer Tezler
- Targeting and activation of antigen specific CD8+ T cells with peptide-major histocompatibility complex I tetramers
Peptit-majör histokompatibilite kompleks I tetramerleri ile antijen spesifik CD8+ T hücrelerin hedeflenmesi ve aktivasyonu
ŞAFAK CEREN USLU ŞIVGIN
Doktora
İngilizce
2025
BiyoteknolojiHacettepe ÜniversitesiTemel Onkoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HANDE CANPINAR
- PA, EF ve LF antijenlerinin immünolojik karakterizasyonları
Immunological characterizations of PA, EF and LF antigens
SERCAN KESKİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
MikrobiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY
DR. AHSEN MORVA YILMAZ
- PA, EF ve LF antijenlerinin farklı kombinasyonları ile biyoetkinlik çalışmaları yapılması
Bioefficiency studies with different combination of PA, EF and LF antigens
ELİF ULUTAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyoteknolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YELDA ÖZDEN ÇİFTÇİ
DR. HİVDA ÜLBEĞİ POLAT
- Konvansiyonel/rekombinant metotlar ile üretilen PA, EF ve LF antijenlerinin aktivitesinin in vitro sistemde incelenmesi ve karşılaştırılması
Investigation and comparison of the activity of PA, EF and LF antigens produced by conventional/recombinant methods in vitro system
AYŞEN GÜNGÖR
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ASUMAN DEMİROĞLU ZERGEROĞLU
DR. DR. YÜKSEL ÇETİN
- BIOPHYSICAL STABILITY EVALUATION OF A VACCINE CANDIDATE CONTAINING PA, EF, AND LF TOXINS AND CONFORMATIONAL STUDIES ON RECOMBINANT PROTECTIVE ANTIGEN
PA, EF VE LF TOKSİNLERİNİ İÇEREN BİR AŞI ADAYININ BİYOFİZİKSEL STABİLİTESİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ VE REKOMBİNANT KORUYUCU ANTİJEN ÜZERİNE KONFORMASYONEL ÇALIŞMALAR
ENES FURKAN SAKAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
BiyoteknolojiGebze Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. ELİF DAMLA ARISAN
PROF. DR. ŞEBNEM ERÇELEN CEYLAN