Geri Dön

Anaplasma capra'nın teşhisinde kullanılmak üzere real-timePCR geliştirilmesi, etkenin karadeniz bölgesinde sığırlardaaraştırılması

Development of real-time PCR to be used in the diagnosis ofAnaplasma capra and its investigation in cattle in blacksearegion

PDF İndir

  1. Tez No: 1007410
  2. Yazar: HÜSNÜ FURKAN ŞAKAR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. KÜRŞAT ALTAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Parazitoloji, Veteriner Hekimliği, Parasitology, Veterinary Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), Karadeniz, Reverse transcription polimerase chain reaction, Black Sea
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Sivas Cumhuriyet Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Anaplasma capra, ilk defa 2012 yılında Çin'de keçiler tespit edilmiş, 2015 yılında insanlarda klinik enfeksiyonlarla ilişkilendirilmiştir. Çin'deki ilk tespitinden günümüze kadar yapılan çalışmalar, bu türün Portekiz, İspanya, Fransa, İsveç, Yunanistan, Türkiye, Kırgızistan, Hindistan, Pakistan, İran, Irak, Angola, Gana, Fas, Çin, Japonya, Güney Kore ve Malezya'yı içeren üç kıtada (Afrika, Asya ve Avrupa) 18 ülkede varlığını ortaya koymuştur. Ayrıca, A. capra keçi dışında çok sayıda omurgalı konak (koyun, sığır, manda, köpek, kedi, at, insan, karaca, munçak, takin, yak, yaban koyunu, serow, onager, çeşitli geyik türleri) ve kene türünde (Haemaphysalis longicornis, Hae. qinghaiensis, Rhipicephalus microplus, R. sanguineus, Ixodes kashmiricus, I. persulcatus, Dermacentor abaensis, D. everestianus ve D. nuttalli) tespit edilmiştir. Anaplasma capra'nın konaklarında tespitinde 16S rRNA, gltA, groEL, MSP2 ve MSP4 genlerini hedef alan PCR ve sekans analizleri kullanılmıştır. gltA ve groEL genlerinin sekans analizleri A. capra'nın iki farklı genotipinin (genotip 1 ve genotip 2) bulunduğunu ortaya koymuştur. Patojenlerin belirlenmesinde real-time PCR'ın konvansinyonel PCR'a göre daha yüksek duyarlılığa sahip olduğu bilinmektedir. Bu tez çalışmasında A. capra'nın teşhisinde kullanılmak üzere groEL spesifik TaqMan real-time PCR metodunun geliştirilmesi, geliştirilen metodun duyarlılık ve saha örneklerindeki etkinliğinin araştırılması ve sonuçların nested-PCR ile karşılaştırılması, A. capra'nın Karadeniz Bölgesi'nde (Samsun, Çorum, Tokat, Kastamonu, Giresun ve Trabzon) sığırlarda varlığı ve yaygınlığının bu iki metotla araştırılması ile sekans ve filogenetik analizlerle bölgedeki genotipilerinin ortaya konulması amaçlanmıştır. TaqMan real-time PCR'da kullanılmak üzere A. capra groEL geni spesifik prob (Acp TaqMan – Probe) ve primerler (Acp TaqMan –F ve Acp TaqMan –R) tasarlanmış, bu prob ve primlerlerin spesifitesi hem biyoinformatik yöntemler hem de yaygın kan patojenlerinin (A. ovis, A. bovis, A. marginale, A. centrale, A. phagocytophilum like-1 ve like-2 miks, Babesia bigemina, B. major, B. occultans, Theileria annulata, T. orientalis, Theileria sp. MK, T. ovis, Theileria sp. OT3 ve T. equi) pozitif kontrol DNA örneklerinin kullanıldığı laboratuvar analizleri ile gösterilmiştir. Bu çalışmada tasarlanan prob ve primer içi en iyi bağlanma ısısı 58ºC, en uygun yoğunluğun ise sırasıyla 150 nM ve 300 nM olduğu tespit edilmiştir. TaqMan real-time PCR'ın ve nested-PCR'ın DNA tespit limitleri sırasıyla 8,25×103 DNA kopyası/µL ve 8,25×104 DNA kopyası olarak belirlenmiş olup, A. capra'nın teşhisinde Taqman real-time PCR'ın nested-PCR'dan 10 kat daha yüksek duyarlılığa sahip olduğu ortaya konulmuştur. Karadeniz Bölgesi'nde sığırlarda A. capra'nın varlığı ve yaygınlığı belirlemek amacıyla 654 EDTA'lı kan örneği toplanmıştır. Bu kanlardan elde edilen total gDNA'lar hem nested-PCR hem de TaqMan real-time PCR ile A. capra varlığı yönünden analiz edilmiştir. Kan örneklerin analizi sonucunda nested-PCR ile %0,92 (6/654) ve TaqMan real-time PCR ile %2,56 (16/654) oranında pozitif sonuç elde edilmiştir. A. capra'nın prevalansı üzerine yaş ve cinsiyetin etkisi belirlenememiştir. Bu sonuçlar Karadeniz Bölgesi'nde A. capra'nın varlığı ve yaygınlığının ilk defa ortaya koymasının yanı sıra saha örneklerinde etkenin tespitinde TaqMan real-time PCR'ın nested-PCR'dan daha başarılı olduğunu göstermiştir. Karadeniz Bölgesi'nde sığırlarda tespit edilen A. capra izolatlarının genotiplerini belirlemek amacıyla groEL geninin DNA dizilimleri belirlenmiş, bu dizilimler GenBankasına sunularak erişim numaraları (PX432044-PX432049) alınmıştır. Elde edilen sekansların filogenetik analizleri sonunca bölgede sığırlarda sirküle olan A. capra izolatlarnın A. capra genotip-1 olduğu görülmüştür. Sonuç olarak bu çalışmayla A. capra'nın teşhisinde kullanılmak üzere groEL spesifik TaqMan real-time PCR metodu geliştirilmiş ve metodunun hem duyarlılığının hem de saha örneklerinde etkinliğinin nested-PCR'dan daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Ayrıca A. capra'nın Karadeniz Bölgesi'nde sığırlarda varlığı ve yaygınlığı ilk defa tespit edilmiş, bölgedeki A. capra genotipinin genotip-1 olduğu gösterilmiştir. Anaplasma capra'nın epidemiyolojisinin araştırılmasına yönelik kapsamlı çalışmalarda TaqMan real-time PCR'ın kullanılmasıyla daha gerçek sonuçların elde edileceği, böylece etkin kontrol stratejilerinin geliştirilmesi ve uygulanmasına olanak sağlayacağı düşünülmektedir.

Özet (Çeviri)

Anaplasma capra was first identified in goats in China in 2012 and was subsequently associated with clinical infections in humans in 2015. Since its initial detection in China, research conducted to date has documented the presence of this species across three continents—Africa, Asia, and Europe—in a total of 18 countries, including Portugal, Spain, France, Sweden, Greece, Türkiye, Kyrgyzstan, India, Pakistan, Iran, Iraq, Angola, Ghana, Morocco, China, Japan, South Korea, and Malaysia. In addition to goats, A. capra has been detected in a wide range of vertebrate hosts (sheep, cattle, water buffalo, dogs, cats, horses, human, roe deer, muntjac, takin, yak, mouflon, serow, onager, and several deer species) as well as in several tick species (Haemaphysalis longicornis, Hae. qinghaiensis, Rhipicephalus microplus, R. sanguineus, Ixodes kashmiricus, I. persulcatus, Dermacentor abaensis, D. everestianus, and D. nuttalli). The detection of A. capra in its hosts has primarily relied on PCR and DNA sequencing targeting the 16S rRNA, gltA, groEL, MSP2, and MSP4 genes. Sequence-based analyses of the gltA and groEL genes have revealed the presence of two distinct genotypes (genotype 1 and genotype 2). It is well-established that real-time PCR exhibits higher analytical sensitivity compared with conventional PCR for pathogen detection. In this thesis aimed to develop a groEL-specific TaqMan real-time PCR assay for the detection of A. capra; to evaluate the sensitivity and field applicability of the developed assay; to compare its diagnostic performance with nested PCR; to investigate the presence and prevalence of A. capra in cattle in the Black Sea Region (Samsun, Çorum, Tokat, Kastamonu, Giresun, and Trabzon); and to determine the circulating genotypes using sequencing and phylogenetic analyses. A species-specific probe (Acp TaqMan-Probe) and primer pair (Acp TaqMan-F and Acp TaqMan-R) targeting the groEL gene were designed for use in the TaqMan real-time PCR assay. The specificity of the primers and probe was confirmed through in-slico analyses and laboratory testing using positive control DNA from several common blood-borne pathogens (A. ovis, A. bovis, A. marginale, A. centrale, A. phagocytophilum-like 1 and 2 mix, Babesia bigemina, B. major, B. occultans, Theileria annulata, T. orientalis, Theileria sp. MK, T. ovis, Theileria sp. OT3, and T. equi). The optimal annealing temperature for the assay was determined to be 58°C, with ideal probe and primer concentrations of 150 nM and 300 nM, respectively. The limits of detection of TaqMan real-time PCR and nested-PCR were estimated at 8.25 × 10³ DNA copies/µL and 8.25 × 10⁴ DNA copies, demonstrating that the TaqMan assay is ten times more sensitive than nested PCR for A. capra detection. To determine the presence and prevalence of A. capra in cattle from the Black Sea Region, 654 EDTA-treated blood samples were collected. Total genomic DNA extracted from these samples was analysed using both nested-PCR and the newly developed TaqMan real-time PCR assay. Positivity rates of 0.92% (6/654) by nested-PCR and 2.56% (16/654) by TaqMan real-time PCR were obtained. No statistically significant association was detected between prevalence and either age or gender. These results constitute the first evidence of A. capra infection in cattle in the Black Sea Region and further demonstrate that TaqMan real-time PCR is more effective than nested-PCR for A. capra detection in the field samples. To determine the genotypes of the A. capra isolates circulating in cattle in the Black Sea Region, groEL gene sequences were obtained and submitted to GenBank, under accession numbers PX432044–PX432049. Phylogenetic evaluation revealed that all isolates belonged to A. capra genotype 1. In conclusion, this study successfully developed a groEL-specific TaqMan real-time PCR assay for the detection of A. capra, demonstrating superior sensitivity and performance for detection of A. capra in the filed samples compared with nested PCR. The study further provides the first evidence of the presence and prevalence of A. capra in cattle in the Black Sea Region, and confirms that genotype 1 is the circulating genotype. It is expected that the use of TaqMan real-time PCR in future large-scale epidemiological studies will provide more accurate results, thereby supporting the development and implementation of effective control strategies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    623066

    İlan ve reklam vergisinin hukuki niteliği

    Legal characteristic of announcement and advertisement tax

    İHSAN BAHRİ BELLEK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Kamu YönetimiAnkara Üniversitesi

    Kamu Hukuku Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CENKER GÖKER

  2. Tez No

    951014

    Van ili Gevaş ilçesinde koyunlarda Anaplasma ovis ve Anaplasma capra türlerinin moleküler yöntemlerle araştırılması.

    Survey of Anaplasma ovis and Anaplasma capra species in sheep in the Gevaş district of Van province by molecular methods.

    İBRAHİM ÖLMEZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    ParazitolojiVan Yüzüncü Yıl Üniversitesi

    Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BEKİR OĞUZ

  3. Tez No

    816547

    Sivas yöresinde mandalarda Theileria, Babesia, Anaplasma ve Ehrlichia türlerinin moleküler yöntemlerle araştırılması

    Survey of Theileria, Babesia, Anaplasma, and Ehrlichia species in buffaloes in Sivas region by molecular methods

    ÖMER FARUK ŞAHİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Veteriner HekimliğiErciyes Üniversitesi

    Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KÜRŞAT ALTAY

  4. Tez No

    230373

    Trakya bölgesi kırsal alanlarında kene ısırığı öyküsü olan kişilerde erlihyoz seropozitifliği

    Seropositivity of ehrlichiosis in population with tick bite history in rural areas of thrace region

    HALUK KILIÇ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    MikrobiyolojiTrakya Üniversitesi

    Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ŞABAN GÜRCAN

  5. Tez No

    25762

    Doğu Avrupa gelişmeleri -Türkiye'ye etkileri-

    Başlık çevirisi yok

    MEHMET ERDEM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1993

    Uluslararası İlişkilerİstanbul Üniversitesi

    Uluslararası İlişkiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BENER KARAKARTAL

Geri Dön