Biointerfacial mechanical modulation of model lipid membranes by gramicidin D: A quartz crystal microbalance with dissipation analysis
Gramisidin D'nin model lipid membranlarda biyoarayüzeysel mekanik modülasyonunun disipasyonlu kuvars kristal mikroterazi analizi
- Tez No: 1010329
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULHALİM KILIÇ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Membran- aktif peptitler iyonik homeostaziyi ve membran bütünlüğünü regüle ederler ve hücre zarı geçirgenliği ve yeniden modellenmesine dair fiziksel prensiplerin detaylı incelenmesi için çok güçlü model sistemlerdir. Bunlardan biri olan Gramisidin D (GrD) yapı ve özellikleri detaylıca çalışılmakta olan kanal oluşturucu bir peptittir. Kısa, oldukça hidrofobik bir pentadekapeptit olan GrD, β6.3 sarmal formunda hücre zarına yerleşir ve karşılıklı yaprakçıklardaki iki monomer dimerleşerek tek parça, su dolu bir gözenek oluşturur. Monovalent katyonlar için seçici geçirgenlik gösteren bu kanal, 4 Å çapında olup dimer yapının uzunluğu yaklaşık 26 Å'dur; bu boyut tipik çift katmanlı bir fosfolipit zarın hidrofobik merkez kalınlığı ile örtüşür. Detaylı kimyasal yapısı belirlenmiş olan GrD; iyon taşınımı, membran mekaniği ve lipit-protein etkileşimi açısından temel bir prob görevi görür. Öte yandan fiziksel özellikleri ise elektrofizyoloji, nükleer manyetik rezonans, moleküler dinamik çalışmaları, floresans ve yüzey duyarlı teknikler ile incelenmektedir. β6.3 sarmal formunun dışında, genel olarak inaktif kanal kabul edilen GrD iç içe geçmiş çift zincirli β sarmal yapılı konformasyonlar oluşturur. Bu yapılar değişen zar çift katman stresi, hidrofobik uyumsuzluk ve artan peptit yoğunluğu gibi durumlarda enerjetik olarak ulaşılabilir hale gelir. Dolayısıyla bu koşul değişikliklerinin iyon kanallarından ziyade iletken olmayan, yüksek yapısal ve mekanik heterojeniteye sahip peptit-lipit komplekslerinin oluşumunu desteklemesi beklenir. Oysaki GrD sadece bir iyon kanalı değildir. Kanal aktif formda dahi, peptitin hücre zarı içine yerleşimi zar kalınlığı, yatay basınç profilleri ve arayüzey hidrasyonu açısından ince fakat önemli değişiklikleri beraberinde getirir. Düşük peptit dozunda GrD tipik olarak genel zar mimarisinde minimal bozulmaları takip eden iyon akısına neden olurken, yüksek doza ulaşıldığında ise yüksek peptit yoğunluklu bölgeler, mekanik yumuşamayı, hatta zar bütünlüğünün bozulmasını tetikler. İyon kanalı baskın rejimden arayüzeydeki bozulmalar ile karakterize edilen rejime evrilen konsantrasyona bağlı bu dönüşüm biyolojik ve yapay zarlardaki literatür çalışmalarında geniş yer bulmuş olup; GrD'nin kanal aracılı gerçekleşen depolarizasyon ve doza bağlı destabilizasyon etkilerinin birleşimiyle ortaya çıkan antimikrobiyal etkinliğinin temelini oluşturur. Bu iki rejim arasındaki denge, zar geometrisi ve yüzey yükü arasındaki karşılıklı etkileşimin sonucunda belirlenir. Biyolojik zarların çok etmenli karmaşık yapısı ve eş zamanlı gerçekleşen birçok fizyolojik durumun varlığı bu etkileşimlerin izole çalışılmasını olanaksız kılar. Biyomimetik hücre zarı platformları bu etkileşimlerin detaylı incelenmesi amacıyla etkin kullanılan araçlardan olup zar yapısını taklit eden ve çeşitli biyomoleküllerin zar ile etkileşimini irdelemek üzere temel yapısal prensipleri korurken aynı zamanda etkileşimin gerçekleştiği çevreyi basitleştirmeye olanak sağlayan sistemlerdir. Düzlemsel destekli lipit çift tabakaları (SLB); yanal olarak kesintisiz, üzerinde bulunduğu katı yüzey ile bütünleşik ve bu yüzey tarafından mekanik olarak sınırlandırılmış bir arayüzey sağlar. Buna karşın, yüzey destekli veziküler katmanlar (SVL) ise yüzeye bağlı sinyal tarama sistemleri ile uyumlu kalırken aynı zamanda veziküler eğriliği ve lümeni korur, kesecikler arası etkileşimlere ve bozulmalara izin verir. Bu kapsamda, aynı peptit SLB ve SVL sistemlerinde özgün mekanik tepkiler oluşturabilir: SLB sistemindeki yüzeye bütünleşik yapılanma geniş kapsamlı bozulmaları baskılarken, SVL ile gelen ilave serbestlik derecesi oluşan mekanik baskının yeniden dağıtılmasını ve vezikül seviyesinde yeniden düzenlenmeleri teşvik eder. İrdelenmek istenen peptit-lipit etkileşimini etkileyen bir diğer faktör ise zarın yüzey yüküdür. Biyolojik zar yapıları farklı gelişimsel düzeylerde moleküler geometri, hidrofobik uzunluk, fonksiyonel grup türü, yüzey yükü bakımından birbirinden ayrışan çok sayıda fosfolipitin değişken kompozisyonlarına bağlı olarak çeşitlenir. Ökaryotik hücreler yüzey yükü bakımından çoğunlukla zwitteriyonik (nötr fakat çift kutuplu) fosfatidilkolin (PC) ve fosfatidiletanolamin (PE) moleküllerinden oluşur. Negatif yüklü fosfatidilserin (PS) ve fosfatidilinozitol (PI) ise farklı fonksiyonel amaçlar için ve genellikle düşük oranlarda bulunur. GrD peptiti, molekülün tamamı göz önünde bulundurulduğunda nötr olsa da sahip olduğu asimetrik dipol ve birden fazla triptofan kalıntıları bölgesel elektrostatik yükler oluşturur ve bu da zara giriş derinliğini ve yönelimini etkiler. PS ise bu etkileşimde lipit paketlemesi, hidrasyonu ve peptitin zara girmesi için gerekli enerji ihtiyaçlarını değiştirir. Bu bağlamda, anyonik lipit baş grupları ile GrD'nin triptofan bakımından zengin uç kısmı arasındaki etkileşiminin sığ ve yüzeye hapsolmuş bozulma modlarına izin vermesi ve nötr zarlarda gözlemlenen mekanik etkiyi dönüştürmesi beklenir. Tüm bu protein-lipid etkileşimleri ve proteinlerin lipit katmanlar içine yerleşimini incelemek üzere moleküler dinamik çalışmaları, floresan mikroskopi, nükleer manyetik rezonans, doğrusal dikroizm, dairesel dikroizm, atomik kuvvet mikroskopisi, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi, disipasyon izlemeli kuartz kristal mikro terazi (QCM-D) gibi, hesaplamalı, etiketlemeli veya etiketlemesiz birçok yönteme başvurulabilir. Bu kapsamda, QCM-D piezoelektriksel prensipler doğrultusunda farklı harmonik seviyelerde izleyebildiği frekans değişimleri yoluyla hidrate kütleyi, disipasyon değişimleri yoluyla viskoelastisiteyi analiz eder. Dolayısıyla, peptit ile lipit katman arasındaki etkileşimden açığa çıkan mekanik değişimleri, herhangi bir etiketleme ve girişimsel müdahaleye ihtiyaç duyulmadan gerçek zamanlı olarak izlemeye olanak sağladığından bu etkileşimlerin analizi için oldukça uygun bir yöntemdir. QCM-D lipitler, peptitler ve etkileşimdeki sıvının bütünleşik mekanik yükünü bir arada algılayabildiğinden, sadece ağırlık değişimini değil hidrasyon seviyesindeki değişimleri, viskoelastik yeniden organizasyonu ve yüzeyden kısmi ayrışmaları da gösterebilir. GrD, melitin, alametisin, magainin gibi gözenek oluşturucu peptitlerle yapılan QCM-D çalışmaları, harmonik-bağımlı ayrışmanın derinliğe bağlı olarak zarın mekanik tepkisinin ve hidrasyon heterojenitesinin değiştiğini ortaya koymuştur. Bu tür sistemlerde farklılaşan harmonik tepkilerinin ortaya çıkma nedeni düşük harmoniklerin yumuşak, hidrate, çözeltiye bakan kısımları algılarken, yüksek harmoniklerin ise daha rijit, yüzeye yakın bölgelere hassas olmasıdır. Böylece yüzeye bağlı, transmembran ve asimetrik olan bozulmaların mutlak viskoelastik modellemeye başvurmaya gerek kalmadan birbirinden ayırt edilebilmesi mümkün olur. GrD üzerine QCM-D ile yapılan öncül çalışmalar düzlemsel zarlara odaklanır ve kanal oluşumunun elektriksel olarak gözlemlenebildiği ancak düşük akustik imzalar oluşturduğu kısıtlı durumlar incelenmiştir. Dolayısıyla aynı GrD konsantrasyonunun düzlemsel SLB ve eğriliği koruyan SVL yapılarında nasıl farklı mekanik tepkiler oluşturduğu ve bunun kısıtlı bir anyonik yüzey yükü değişiminden nasıl etkilendiğine dair literatürdeki bilgiler yetersizdir. İlaveten kanal oluşturan ve oluşturmayan formlar arasındaki farklılıklar serbest veziküller düzeyinde ve hücre zarlarında gösterilmişken, bunun yüzey destekli platformlarda ve geometri ve elektrostatik etkinin değiştiği koşullarda sistematik bir incelemesi gerçekleştirilmemiştir. Bu tez çalışmasında QCM-D çalışmaları floresan mikroskopi ve sıvı fazlı analizlerle beraber kullanılarak GrD'nin lipit zarları nasıl bozduğu geometri ve yüzey yükündeki değişiklerin sistematik incelemesi ile irdelendi. Bu bağlamda SLB yapısı yüzey-bütünleşik düzlemsel geometriyi temsil ederken, SVL vezikül eğriliğini ve hacimsel serbestlik derecesini koruyan geometri için kullanıldı. İki farklı lipozom kompozisyonu- DOPC ve DOPC:DOPS (92:08)- (DO: dioleil) kontrollü bir yüzey yükü değişimi için tercih edildi. Tüm değişkenlerin birleşimiyle, lipit-GrD etkileşimini düzlemsel ve eğriliği koruyan membran modellerinde ve yüzey yüküne bağlı olarak irdelerken klasik kanal oluşturucu ve membran bozucu rejimleri ayrıştıran, harmonik çözümlü mekanik parmak izlerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmada ince film hidrasyon ve ekstrüzyon yöntemiyle elde edilen lipozomlar Dinamik Işık Saçılımı (DLS) ve Zeta Potansiyel ölçümleri ile karakterize edildi. PBS tamponunda, DOPC ve DOPC:DOPS (92:08) lipozomları için hidrodinamik çap sırasıyla 110 nm ve 119 nm ölçüldü; her iki kompozisyonun da homojen ve monodispers (PDI<0.2) bir yapı sergilediği teyit edildi. DOPC lipozomlarının yüzey yükü -6,55 mV iken %8'lik DOPS ilavesiyle yüzey yükü -23,23 mV değerine ulaştı. Anyonik SLB oluşumu kullanılan yüzeyde divalent katyon varlığını gerektirdiğinden MgCl2 ilaveli PBS tampon kullanıldı. Mg2+ iyonları, DOPC yüzey yükünde anlamlı bir değişim yaratmazken, DOPS üzerinde perdeleme etkisiyle yükte hafif bir azalma sağladı. Hidrodinamik çap sırasıyla 108,7 nm ve 115,8 nm olarak ölçüldü, Mg2+ varlığı boyut ve PDI değerlerini önemli ölçüde değiştirmedi. Lipozomların yapısal karakterizasyonunun ardından, serbest lipozomların GrD ile etkileşimi sonucunda oluşan fiziksel değişimler takip edildi. Optik yoğunluk ölçümleri ile %1 oranında fosforlu lipit ilaveli DOPC lipozomları ile gerçekleştirildi. 20-300 µg·mL-1 GrD ile 30 dakika inkübe edilen lipozomlar devamında 90 dakika boyunca takip edildi. 20 µg·mL-1 için optik sinyal lineer kaldı. Artan konsantrasyonlar için ise sinyal yüksekliği konsantrasyonla orantılı olarak ilk 60 dakika boyunca artış gösterdi, sonraki 30 dakikada ise büyük, yoğun parçacıkların sedimentasyonuyla optik düzlemden uzaklaşmasının sonucu olarak kademeli bir azalma oluşmuştur. Genel olarak bu ölçümler; GrD'nin lipozom süspansiyonlarında konsantrasyona bağlı farklı yapısal tepkiler tetiklediğini göstermiştir. Düşük peptit seviyelerinde ihmal edilebilir düzeyde değişiklikler gözlemlenirken, yüksek konsantrasyonlarda lipozom kaynaklı makro-agregatların kademeli oluşumu ve artışı söz konusudur. Peptidin fonksiyonel iyon kanalı oluşturma kapasitesi ise, piranin boyasının lipozom içerisine enkapsüle edildiği sızıntı analizi ile teyit edildi. Ortam pH'ındaki değişimleri takiben, karakteristik bir spektral kayma sergilemektedir. Lipozom içerisinde enkapsüle edildiğinde ise boyutundan ötürü dışarı sızması mümkün değildir. Yine GrD'nin kanal oluşturduğu durumlarda da boyutu ve yükü dolayısıyla geçişi söz konusu değildir. Bu nedenle, GrD'nin fonksiyonel kanal oluşturduğu veya zar bütünlüğünü tamamen bozduğu durumlar dışında sinyal değişimi gözlemlenemez. Bu doğrultuda, fonksiyonel GrD varlığını göstermek amacıyla iki aşamalı bir boya sızıntı analizi gerçekleştirildi. Birinci aşamada çökelti oluşturmayacak en yüksek konsantrasyon belirlendi (≤25 µg·mL-1 GrD, 1 mg·mL-1 lipit için). İkinci aşamada ise 20 µg·mL-1 GrD varlığında ani pH değişikliğine maruz bırakılan lipozomlar için ~9 pH varlığında piranin için karakteristik bazik spektrum gözlemlendi. Bu bulgular, iyon akısının gerçekleştiğini ve GrD'nin zar içerisine kanal-aktif formda yerleştiğini teyit etti. GrD'nin düzlemsel geometrideki yapay zarlar üzerine etkisini analiz etmek amacıyla %1 oranında floresan etiketli lipit içeren DOPC lipozomları ile SLB oluşturuldu. 20 µg·mL-1 GrD varlığında floresan mikroskop altında 130 dakikalık süre boyunca gerçek zamanlı yüzey incelemesi gerçekleştirildi. Başlangıçta teyit edilen homojen zar tabakası GrD eklenmesini takiben 7. dakikadan itibaren yerel kümelenmeler gösterdi. Zaman içerisinde yüzeyde büyük, hareketsiz agregat kümeleri ve daha küçük hareketli parçacıkların varlığı tespit edildi. Altı farklı zaman aralığı için varyasyon katsayıları (CV) hesaplanarak , heterojenite artışı niceliksel olarak da ortaya konuldu. QCM-D çalışmalarında düzlemsel destekli lipit çift tabakası (SLB) silika yüzeyler; yüzey destekli veziküler katman (SVL) oluşumu için ise altın yüzeyler kullanıldı. PBS tamponu içerisinde hazırlanan DOPC:DOPS (92:08) lipozomları ile SLB oluşumu sağlanamadığından, elektrostatik itmeyi maskelemek amacıyla Mg2+ katkılı PBS tampon çözeltisine geçildi. Oluşturulan SLB yapıları için ölçülen frekans ve disipasyon değişimleri literatür ile uyumlu olarak gözlemlendi ve bu yapıların homojen olduğu literatür verileri ile kıyaslanarak teyit edildi. SLB geometrisi için 2 µg·mL-1, 10 µg·mL-1 ve 20 µg·mL-1 GrD konsantrasyonları test edilirken; SVL geometrisi için ise 2 µg·mL-1 ve 10 µg·mL-1 seçildi. Çalışmanın genelinde 2 µg·mL-1 düşük konsantrasyon, 10 µg·mL-1 ve 20 µg·mL-1 ise yüksek konsantrasyon olarak adlandırıldı. Bu dozlar, S. aureus'a karşı Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MIC) ve hemolitik konsantrasyon değerlerini kapsayacak şekilde seçildi. Çalışmalar, biyolojik ortamı taklit etmek ve kütle transferini standardize etmek amacıyla sürekli akış koşullarında gerçekleştirildi. Yüzey geometrisi, lipit kompozisyonu ve peptit dozu gibi temel değişkenlerin eş zamanlı olarak değerlendirildiği bu çok parametreli tasarım; GrD-membran etkileşiminin karmaşık doğasını sistemik bir yaklaşımla analiz eden QCM-D çalışmaları için kapsamlı bir temel oluşturdu. Nötr DOPC ile oluşturulan SLB'lerde düşük dozlu peptite maruz kalma yalnızca küçük akustik izler oluşturdu. Sinyaller hassas, neredeyse çakışık (uniform) Δf ve ΔD değişiklikleri oluşturdu. Harmonik ayrımına ulaşmadan önce uzun durağan bir zaman dilimi geçti. Bu değişim kinetiği yavaş monomer girişi ve çift katman arası dimerleşme için uygundu. Aynı zamanda dimer ile yerleştiği zar arasındaki hidrofobik eşleşme ve yeniden organizasyon için gerekliydi. Bu kinetik bariyer aşıldıktan sonra, 3. ve 5. harmoniklerdeki baskın ayrışma da geniş Δf düşüşü ve ΔD artışı ile belirginleşti ve yumuşak, hidrate ve yapısal olarak heterojen dış yaprakçığa atfedildi. Yıkama sonrasındaki frekans artışı, zarın zayıfladığını ve hafif bağlı lipid-peptit parçacıklarının ayrıldığını gösterdi. Yüksek peptit seviyelerinde ise nötr SLB yanıtı temelden değişti. Etkileşim aniden başladı; 3. harmonikte keskin bir frekans düşüşü ve büyük bir disipasyon artışı gözlenirken, yüksek harmonikler nispeten beraber ilerledi. Bu harmoniğe bağlı patern, yüzeye yakın rijit tabakaya kıyasla dış yaprakçıkta hızlı bir yumuşama ve hidrate yüklenme olduğunu kanıtladı. 5. harmonikte gözlenen geçici pozitif Δf değişimi ve buna eşlik eden yüksek disipasyon; yerel hidrasyon düzenlemesi veya gevşek bağlı lipit-peptit kümelerinin kısmi ayrılması nedeniyle etkin bağlı kütlede kısa süreli bir azalmaya işaret etti. Bu tür belirgin kütle kayıpları faklı membran-aktif peptitler için de gözlemlenmiş olup malzeme kaybından ziyade hidrasyonla ilişkili değişimler olarak tanımlanmıştır. Nötr DOPC SVL'ler, eğriselliğin bu etkileri nasıl artırdığını gösterdi. Düşük konsantrasyonlarda bile GrD, ani bir Δf düşüşü ve güçlü ΔD artışı tetikledi; bu durum peptidin dış katmanla etkileşimi sonucu oluşan hidrate bir tabakayı yansıttı. Yüksek peptit maruziyetinde, 3. harmonikteki büyük disipasyon artışları ve 5. harmonikteki geçici pozitif sapma, vezikül iskeleti üzerinde peptitçe zengin ve yüksek derecede disipatif bir dış bölgenin oluştuğu heterojen bir mimariyi ortaya koydu. DOPS ilavesi, yüke bağlı belirgin davranış farklılıkları yarattı. Anyonik SLB'lerde, düşük peptit seviyeleri, başlangıçta özellikle 3. harmonikte belirgin olan küçük bir pozitif Δf sapmasına neden oldu, daha belirgin artış sinyalleri sonradan gözlemlendi. Bu özellikler, yerel baş grup düzenlenmesi veya bağlı hidrasyondaki kısa süreli azalmalarla ilişkilendirildi. Mg2+ varlığındaki bu görünür kütle kaybının, peptit yerleşimi sırasında oluşan iyon yer değişimi veya Mg2+ aracılı köprülerin bozulması sonucu oluşan dehidrasyonu yansıtabileceği değerlendirildi. Yıkama sonrasında ölçülebilir bir kütle kaybı gözlenmemesi, yüklü membranlarda muhtemelen Mg2+ aracılı bir elektrostatik dengelenmeyle etkisi artan güçlü bir peptit-lipit etkileşimi olduğunu ortaya koydu. Yüksek konsantrasyonda ise, daha keskin bir Δf yükselişi ve diğer harmoniklerde daha kısıtlı olan tepki sinyalleri sığ, dış yaprakla sınırlandırılmış bir bozulmaya işaret etti. Dış yaprakçıktaki baskın sinyallerin yıkamadan sonra da devam etmesi anyonik yüzeyde yeniden düzenlenen bölgenin yüzeye kuvvetli bir şekilde bağlı olduğunu gösterdi. Öte yandan, anyonik SVL'lerde geometriye özgü ilave davranışlar gözlendi. Δf yanıtları dar bir aralıkta kalarak sınırlı bir harmonik ayrışması gösterirken, disipasyon yanıtları harmoniğe oldukça bağımlı hale geldi. 5. harmonikteki seçici artış, GrD'nin vezikül kabuğuna derinlemesine nüfuz etmek yerine, baş grup/üst-açil bölgesine yakın yüzeysel bir arayüzey bölgesinde hapsolduğunu gösterdi. Bu yüzeysel yerleşim, GrD'nin triptofan bakımından zengin uçlarının membran-su arayüzeyinde lokalize olduğunu gösteren yapısal çalışmalarla uyum sergiledi. Anyonik membranlarda bu kısıtlamaların, fosfatidilserin baş gruplarını birbirine bağlayan ve yerel paketlenmeyi sıkılaştırarak derin yerleşimi engelleyen Mg2+ köprüleri ile daha da güçlendiği sonucuna varıldı. DOPS içeren SVL'lerde gözlenen düşük Δf genliği, sınırlı harmonik ayrışması ve daha hızlı kinetik, elektrostatik olarak kısıtlanmış yüzeysel bir yerleşim rejimini destekledi. Tüm bu çalışmada yüksek zar parçalayıcı etki gösteren yüzey-aktif peptit sınıflarına kıyasla, GrD'nin sınırları belirli ve doza bağlı bir yüzeye giriş ve arayüzey stresi ile zarı bozduğu belirlendi. QMC-D'de parçalayıcı peptitler genel olarak frekansın başlangıca dönmesi ve disipasyon düşüşü ile karakterizedir. Çalışmada bu sinyal türünün gözlemlenmemesi, yüksek ve sürdürülebilir frekans düşüşüne eşlik eden yüksek disipasyon ve belirgin harmonik ayrışması tamamen parçalanıp çift katmanlı bir tabaka oluşturmak yerine vezikül bozulması, çökme ve hidrate peptit-lipid birikimine eşlik eden parçacık oluşumunun gerçekleştiğini göstermektedir. Sonuç olarak, geometri, yüzey yükü ve peptit dozunu içeren bütünleşik bir mekanik tablo ile GrD'nin yalnızca bir iyon kanalı olarak tanımlanamayacağını ortaya koyuldu.
Özet (Çeviri)
The rapid evolution of multidrug-resistant bacteria necessitates the development of novel therapeutic strategies. Membrane-active peptides (MAPs) have emerged as promising candidates due to their ability to bypass traditional resistance mechanisms by directly targeting the structural integrity of the bacterial envelope. However, a fundamental challenge in biophysics remains in deciphering how these peptides perturb biological boundaries. The functional outcome of such interactions is dictated by a complex mechanical balance between the peptide and the host lipid architecture. Gramicidin D (GrD), a small and structurally well-defined pentadecapeptide, serves as a prototypical model for MAPs. While traditionally studied through the lens of ion conductivity, its role in large-scale structural remodeling of the membrane remains less understood. To isolate these interactions from complex cellular dynamics, this study utilizes biomimetic membrane models, specifically; Supported Lipid Bilayers (SLBs) and Supported Vesicular Layers (SVLs). These platforms provide the necessary stability for high-resolution, surface-sensitive characterization-most notably overtone-resolved Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D). A comprehensive, depth-dependent perspective on the membrane's viscoelasticity is gained by probing the lipid architecture at varying distances from the sensor surface through the analysis of multiple overtones. This approach allows for the precise quantification of how peptide partitioning influences the mass, thickness, and mechanical stiffness of the membrane in real-time and non-invasive manner. This study provides a unified mechanistic picture where membrane geometry, surface charge, and peptide density jointly determine the nature of GrD-induced perturbations. The experimental design contrasts planar SLBs with curvature-maintaining SVLs, utilizing both neutral (DOPC) and anionic (DOPC:DOPS 92:08) compositions across two distinct dose-dependent regimes. These biophysical investigations were corroborated by solution-phase experiments. Optical density (OD) measurements indicated a concentration-dependent transition: while low concentrations remained stable, increased peptide levels induced the formation of large macro-aggregates, leading to an initial rise in absorbance followed by a decrease due to sedimentation. The functional integration of GrD was further validated through pyranine dye-leakage assays, which confirmed ion-channel activity under induced pH gradients. Complementary fluorescence microscopy revealed a stark morphological transition from a continuous, homogeneous bilayer to a heterogeneous, disrupted landscape characterized by both large immobile and small mobile aggregates. QCM-D data provided deep insights into the mechanical“fingerprints”of these interactions. In SLB systems, the rigid substrate suppresses large-scale deformations, confining GrD activity to hydration-driven responses within the outer leaflet. In contrast, SVLs accommodate curvature- and elasticity-mediated rearrangements, enabling significantly larger shifts in coupled mass and dissipation that reflect a deeper structural remodeling of the vesicle shell. The introduction of anionic DOPS and Mg2+ ions further modulates this landscape, inducing a charge-dependent regime marked by transient positive frequency excursions. These signatures signify localized hydration rearrangements and an electrostatically constrained insertion mode, where GrD is anchored within a shallow interfacial zone near the headgroups. In this study, the behavior of Gramicidin D (GrD) is shown to be governed by a complex interplay between environmental boundary conditions and peptide polymorphism. GrD-induced membrane perturbation is characterized as a concentration-dependent continuum, ranging from functional channel insertion to large-scale mechanical destabilization. The comprehensive biomechanical framework is established by reconciling acoustic signatures with independent solution-phase assays. Consequently, overtone-resolved QCM-D serves as a sensitive diagnostic platform for distinguishing subtle peptide-insertion kinetics from structural collapse, offering critical insights for the design and evaluation of next-generation membrane-active therapeutic agents.
Benzer Tezler
- Processing and characterization of brick-and-mortar structured bulk bio-inspired composites
Biyolojik malzemelerden esinlenilmiş tuğla-ve-harç yapılı hacimli kompozitlerin üretimi ve karakterizasyonu
SELEN NİMET GÜRBÜZ
Doktora
İngilizce
2013
Metalurji MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ARCAN FEHMİ DERİCİOĞLU
- Processing and characterization of glass flake reinforced thermoplastic polymer matrix bio-inspired bulk lamellar composites
Cam plaka takviyeli termoplastik polimer matrisli doğadan esinlenilmiş hacimli kompozit üretimi ve karakterizasyonu
AYLİN GÜNEŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
Metalurji MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ARCAN FEHMİ DERİCİOĞLU
- Effects of blend morphology and layered silicates' localization on the mechanical, thermal and viscoelastic properties of multiphase biopolymeric systems
Harman morfolojisinin ve tabakalı silikatların lokalizasyonunun multifazlı biyopolimerik sistemlerin mekanik, termal ve viskoelastik özellikleri üzerine etkisi
YUSUF KAHRAMAN
Doktora
İngilizce
2022
Polimer Bilim ve Teknolojisiİstanbul Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MOHAMMADREZA NOFAR
- Bazalt ve cam elyaf takviyeli biyo-bazlı poliamid kompozit malzemelerin hazırlanması ve özelliklerinin incelenmesi
Preparation and investigation to properties of basalt and glass fiber reinforced bio-based polyamide composite materials
UĞUR ULUSOY
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
Polimer Bilim ve TeknolojisiYalova ÜniversitesiPolimer Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MEHMET ARİF KAYA
- Polilaktik asit esaslı kenevir elyaf takviyeli biyo-kompozitlerin farklı modifikasyon yöntemleri ile üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of polylactic acid based hemp fiber reinforced bio-composites by different modification methods
NURHAN ÇEVİK ELEN
Doktora
Türkçe
2023
Mühendislik BilimleriKarabük ÜniversitesiEndüstriyel Tasarım Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSA YILDIRIM
DOÇ. DR. YASİN KANBUR