Tatlı patatesten asit fosfataz enziminin kısmi saflaştırması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi
The Purification and the study of the kinetic properties of acid phosphatase enzyme obtained from sweet potatoes
- Tez No: 101418
- Danışmanlar: DOÇ.DR. YÜKSEL AVCIBAŞI GÜVENİLİR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2001
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 78
Özet
TATLI PATATESTEN ASİT FOSFATAZ ENZİMİNİN KISMİ SAFLAŞTIRILMASI VE KİNETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ ÖZET Enzimler biyokimyasal katalizörlerdir. Enzimlerin katalitik özelliklerinin belirlenmesinden sonra endüstride geniş kullanım alam bulmuşlardır. Olağanüstü bir seçicilik ve reaktİviteye sahiptirler. Organizma için çok sayıda kimyasal reaksiyonu aktive ederek düzenlerler. Zamanın başlangıcından beri ekmek yapımı şarap ve peynir hazırlanması ve ilaç yapımında kullamlmışlardrr. Enzimler bilimsel araştırmalar ve tam koyma amacıyla katalitik özelliklerinin arttırılması hedeflenerek saflaştınlmışlar ve kimyasal reaksiyonlarla bazı fizyolojik tedavilerde kullanılmışlardır. Enzimler bir reaksiyonun hızını 1012 kat arttırabilirler. Bir preparasyonun katalitik aktivitesi, substratm yok olma hızı ya da ürünün oluşma hızının belirlenmiş substrat konsantrasyonu, sıcaklık, pH vb. belirlenmiş koşullar altında uygun bir prosedürle tespit edilir. Katalitik aktivitenin uluslar arası tanımı bir ünitedir ve (U) ile gösterilir. Bir mikromol (10"6 mol) substratm 1 dakikada ürüne dönüşme hızı olarak tanımlanır. Bir enzimin spesifik aktivitesi (U/mg) olarak ölçülür ve bu spesifik aktivite saflaştırma sırasında belli bir sabite ulaşır. Bu da elde edilen saf proteinin göstergesidir. Fosfat esterleri her organizmada yaygın bir şekilde bulunurlar. Nükleik asitler, glukoz-6-fosfat gibi metabolik ara ürünler enerji olarak zengin substratlar (AMP, kreatin fosfat ) buna örnek oluşturmaktadır. Fosfat grupların transferi sırasında pek çok metabolik ara ürünler aktive olmakta ve aynı şekilde fosfat esterleri hızlı bir şekilde parçalanmaktadır. Fosfo esterlerin fosfat gruplarından hidrolitik olarak uzaklaştırılmaları fosfatazlarla katalizlenir. Sinyal transdüksiyonu esnasında görev alan enzimler gibi pek çok fosfataz yüksek oranda substrat spesifiktir. Bununla beraber belirli sayıdaki fosfatazlar her fosfat esterini parçalarlar. Bu tür spesifik olmayan enzimler metabolitlerin ya da besinlerin katabolik parçalanmasında görev alırlar. Fosfatazlann optimum aktiviteye sahip oldukları pH' a bağlı olarak asidik fosfatazlar (asit fosfatazlar) ve alkalin fosfatazlar olarak sınıflandırılırlar. Alkalin fosfatazlar divalent kofaktör olarak metal iyonları gerektirirler ve hayvan dokuları ile bakterilerde bulunurlar. Asit fosfatazlar bitkiler de dahil olmak üzere pek çok organizmada bulunurlar. xAsit fosfataz ortofosforikmonoester fosfohidrolazdır. Bu enzim çeşitli ortofosfat esterlerinin hidrolizini ve transfosforizasyon reaksiyonlarını katalizlerler. Asit fosfatazlar doğada, özellikle insan vücudunda prostat bezi, karaciğer, dalak, böbrek ve kan hücrelerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu enzimin bol bulunduğu bitkiler tatlı patates, buğday filizi, badem, kolza tohumu ve arpa filizleridir. Bu enzim ayrıca maya ve küfte bulunur. Patates,buğday filizi, prostat ve kolza tohumu fosforotioyik asidin o- sübstitüe monoesterini hidrolizlerler. Bu bir oksijen bağının gerektiğini ve bunun bir spesifik sübstitüe olduğunu belirtir. Bu enzim asit fosfataz için yapılan herhangi bir çalışmada yüzey inaktivasyonunu gerektirir. Aynı şekilde başlangıç hidrolitik hızlarına her zaman ulaşılamaz ve kinetik davranış yeni herhangi bir çalışmanın geliştirilmesi için kontrol edilmelidir. Jelatin, büyükbaş hayvan serum albümini, yumurta albümini ve Tween-80 enzimi inaktivasyona karşı korur. Deterjanla koruma da etkilidir. Enzim çalışmalarının çoğu asit fosfataz prostatik dokuda çok aktif olduğundan prostatik asit fosfataz üzerinedir. Plazma serumundaki prostatik asit fosfatazın seviyesinin yükselmesi prostat kanserini belirtisi olabilir. Asit fosfatazın aktivitesi çeşitli kaynaklarda göreceli olarak daha düşüktür. Bu, asit fosfataz aktivitesinin belirlenmesinde güçlükler yaratabilir. Diğer yandan enzimin katalitik aktivitesi kararsızdır ve bu da endüstriyel kullanımı şuurlar. Bu çalışmada tatlı patatesten asitfosfataz ekstrakte edilmiş ve kısmi olarak saflaştırılmıştır. Bir enzimin izolasyonu işleminde en önemli test aktivite testidir. Fosfataz asidik pH' da aktif olduğundan 30 dakika pH = 4.4'te ve 37 °C optimum sıcaklıkta inkübe edilir ve reaksiyon NaOH ile durdurulur. Bu çalışmalar değişik pH değerlerinde, sıcaklıklarda ve değişik inkübasyon zamanları denenerek yapılmıştır. Elde edilen asit fosfataz erıziminin optimum pH değerinin belirlenmesi için değişik pH'larda tampon çözeltiler hazırlanmış ve bu pH değerinde enzim aktivite hızı belirlenmiş ve pH aktivite grafiği çizilmiştir. Grafikten optimum pH değeri belirlenmiştir. Elde edilen asit fosfataz enziminin optimum sıcaklığım belirlemek için inkübasyon değişik sıcaklıklarda yapılmış, her sıcaklığa karşılık gelen enzim aktivite hızı belirlenmiş, sıcaklık aktivite grafiği çizilmiş ve grafikten optimum sıcaklık belirlenmiştir. Elde edilen asit fosfataz enziminin optimum inkübasyon zamanım belirlemek için inkübasyon zaman aralıkları değiştirilmiş, her zaman aralığında enzim aktivite hızı belirlenmiş, zaman-aktivite grafiği çizilmiştir. Elde edilen grafikten optimum inkübasyon zamanı belirlenmiştir. xıElde edilen asit fosfataz enziminin optimum substrat konsantrasyonunu belirlemek için substrat konsantrasyonu değiştirilerek her substrat konsantrasyonuna karşılık gelen enzim aktivite hızı belirlenmiş ve konsantrasyon- aktivite grafiği çizilmiştir. Elde edilen grafikten optimum substrat konsantrasyonu belirlenmiştir. Enzim saflaştırma işleminin son aşamasında 0.05 M sitrat tampon ile dengeye ulaştırılmış bir DEAE- Sephadex A-25 kolonundan geçirilmiştir. Protein konsantrasyonu ve enzim aktivitesi belirlenmiştir. Bu sonuçlarla çok sayıda stabilite veaktivite profilleri belirlenmiştir. Optimum pH değeri 5.5-6.5 arasında; optimum sıcaklık 30°C ve inkübasyon için gereken zaman ise 30 dakika olarak belirlenmiştir. Kolondan geçirme sonrasında 24 kat saflaştırma elde edilmiştir. X11
Özet (Çeviri)
THE PURIFICATION AND THE STUDY OF THE KINETIC PROPERTD2S OF ACID PHOSPHATASE ENZYME OBTAINED FROM SWEET POTATOES SUMMARY Enzymes are biochemical catalysts. After the catalytic properties' determination of the enzymes, they found too many usage areas in the industry. They have an extraordinary specificity and reactivity. They activate and regulate too many chemical reactions for the organism. Since the beginning of the history they are used for the bread making, wine and cheese preparation and also for the pharmacuticals. Enzymes are purified for the scientific researches and diagnostics in order to influence their catalytic properties and used in chemical reactions and some physiological treatments. Enzymes may increase the rate of a reaction by as much as 1012 fold. The catalytic activity öf a preparation is determined by a suitable procedure in which the rate of disappearance of substrate or the rate of appearance of product is determined under defined conditions of substrate concentration, temperature, pH, etc. The international definition of catalytic activity is a unit (U) and corresponds to a rate of conversion of one micromole (10"6 mole) of substrate to product per minute. The specific activity of an enzyme is measured as U/mg, and this specific activity should rise during purification unit a constant value, indicative of pure protein, is obtained. Phosphate esters are widely distributed in any organism. Nucleic acids, metabolic intermediates like glucose-6-phosphate, energy-rich substrates (AMP, creatine phosphate ) are some obvious examples. While many metabolic intermediates are activated through the transfer of phosphate groups, it is equally important that phosphate esters can also be rapidly broken down. The hydrolytic removal of phosphate groups from phosphoesters is catalyzed by phosphatases. Many phosphatases are highly substrate-specific, like those enzymes involved in signal transduction. A number of phosphatases, however, cleave virtually any phosphate ester. Such unspecific enzymes function mainly in the catabolic breakdown of metabolites or nutrients. Depending on the pH at which such phosphatases have optimal activity, we distinguish between acidic phosphatases ( also called acid phosphatases ) and alkaline phosphatases. The latter enzymes require divalent metal ions as cofactors and are common in animal tissues and bacteria. Acidic phosphatases are widely distributed in many organisms including plants. X1UAcid phosphatase is an orthophosphoric monoester phosphohydrolase. This enzyme catalyzes hydrolysis of a variety of orthophosphate esters and transphosphorylation reactions. Acid phosphatase is found widespread throughout nature, mostly in various organs in the human body such as the prostate gland, liver, spleen, kidney and blood cells. The plant sources which are rich in enzyme are sweet potato, wheat germ, almonds, rapeseed and barley seeds. The enzyme is also present in yeasts and molds.Acid phosphatase from wheat germ, potato, prostate and rapeseed doesn't hydrolase S- substituted monoesters of phosphorothioic acid. It hydrolyses O-substituted monoesters of phosphorothioic acid under identical conditions. This suggests that an oxygen linkage is required and it can't be substituted by sulphur. This enzyme is subject to surface inactivation in any assay for acid phosphatase. Accordingly, reproducible initial hydrolytic rates are not always achieved, and the kinetic behaviour should be checked in any new assay development. A variety of agents; gelatin, bovine serum albumin, egg albumin and Tween-80 protect the enzyme against inactivation. Protection by detergent is also very effective. Most of the enzyme assays are of prostatic acid phosphatase, since acid phosphatase is very active in human prostatic tissue. Determination of significant levels of prostatic acid phosphatase in the serum of plasma is an indication of the prostatic cancer. The activity of acid phosphatase is relatively low in different sources. This can present some difficulties for the determination of acid phosphatase activity. On the other hand, the catalytic activity of the enzyme is unstable and this limits its industrial utilisation. In this study, an acidic phosphatase from sweet potatoe is extracted and partially purified. The most important prerequisite for any enzyme isolation is an activity test. The enzyme is incubated for 30 minutes at ph 4.4 at an optimum temperature of 37 °C and the reaction is stopped by adding NaOH. These studies are realised at different pH values, different temperatures and using different incubation times. To find the optimum pH value for the acid phosphatase enzyme obtained, buffers of different pH values are prepared and according to the enzyme activity rates at each pH value, a pH-activity graph is drawn. From the graph obtained optimum pH value is determined. To find the optimum temperature for the acid phosphatase enzyme obtained, the incubation is made at different temperatures and according to the enzyme activity rates at each temperature, a temperature-activity graph is drawn. From the graph obtained optimum temperature is determined. To find the optimum incubation time for the acid phosphatase enzyme obtained, the incubation time intervals are changed and according to the enzyme activity rates at each time interval, a time-activity graph is drawn. From the graph obtained optimum incubation time is determined. XIVTo find the optimum substrate concentration for the acid phosphatase enzyme obtained, the substrate concentration are changed and according to the enzyme activity rates at each substrate concentration, a concentration -activity graph is drawn. From the graph obtained optimum substrate concentration is determined. The final stage for the purification of the enzyme is accomplished by passing the enzyme preparation through a DEAE Sephadex A-25 column, equilibrated by a 0.05 M citrate buffer. The protein concentration and the enzyme activity is determined. With these results a variety of stability and activity profiles are determined. The optimum pH value is determined as a value between 5.5- 6.5, the optimum temperature is determined as 30 ° C and the optimum time required for the incubation is determined as 30 minutes. After passsing the enzyme preparation through a DEAE Sephadex A-25 column a purification of 24 fold was realised.
Benzer Tezler
- Portekiz Gandera yerel tatlı patates (Ipomoea batatas (L.) Lam) genotipinin in vitro mikroçoğaltılması üzerine bitki büyüme düzenleyicilerinin ve besi ortamlarının etkisi
Effect of plant regulators and medium culture on in vitro micropropagation of Portugal Gandera local sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) genotype
GÜLBAHAR BAYDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyoteknolojiDicle ÜniversitesiBahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ VEDAT PİRİNÇ
- Agrobacterium-mediated transformation of Turkish sweetpotato cultivar using a marker gene
Türk tatlı patates çeşidinde Agrobacterium aracılığı ile markör gen transferi
SENA DAMLA OKTAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BAHAR SOĞUTMAZ ÖZDEMİR
- Sıcak hava-mikrodalga kombinasyonu ile kurutulan balkabağı ve tatlı patatesin kuruma karakteristiklerinin belirlenmesi ve yanıt yüzey yöntemiyle optimizasyonu
Determination of drying characteristics of pumpkin and sweet potato dried with hot air-microwave combination and optimization by response surface methodology
SENEM TÜFEKÇİ
Doktora
Türkçe
2024
Gıda MühendisliğiPamukkale ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SAMİ GÖKHAN ÖZKAL
- Aureobasidium pullulans ile pullulan üretimine etki eden çeşitli parametrelerin incelenmesi
Investigation of various parameters affecting on pullulan production by Aureobasidium pullulans
GAMZE NUR MÜJDECİ
Doktora
Türkçe
2019
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEKİYE YEŞİM ÖZBAŞ
PROF. DR. MELEK TİJEN BOZDEMİR
- Tatlı rezene (foeniculum vulgare mill. var. dulce)'de bitki sıklığının verim ve verim öğeleri üzerine etkileri
The Effects of plant density on yield and yield components of sweet fennel (foeniculum vulgare mill. var. dulce)
FATMA ÖZKAN (AKGEYİK)