Geri Dön

Recombinant production and biochemical characterization of novel CYP102S from hisaralan and antarctica identified by metagenomics approaches

Hisaralan ve antarktika'dan metagenomik yaklaşımla yeni tanımlanan CYP102S enzimlerinin rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu

  1. Tez No: 1015885
  2. Yazar: ELİF MEHVEŞ ÖZER
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biochemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Enzimler, aktivasyon enerjisini düşürerek çok çeşitli biyotransformasyonları yapabilen biyomoleküllerdir. Yüksek regio- ve stereo-selektiviteleri bulunması sayesinde kimyasal yollarla ve reaksiyonlarla elde dilmesi zor, pahalı veya çok fazla ara ürün oluşturan endüstriyel uygulamalarda çevre dostu birer alternatiftirler. Her ne kadar ribozim gibi protein olmayan enzimler de bulunuyor olsa da enzimler genellikle protein yapıdadırlar. Spesifiteleri ve fonksiyonları sayesinde enzimlere büyük ilgi duyuluyor olmasına rağmen, endüstriyel uygulamalar genellikle enzimler için çok sert işlem koşulları içermektedir. Yüksek veya düşük sıcaklık, tuz ve pH, ya da çeşitli kimyasallara dayanabiliyor olma gibi gereklilikler enzimlerin endüstriyel uygulamalarını kısıtlar niteliktedir. Enzimlerin bu operasyon koşullarına dayanamıyor olması, özellikle ekstremofilik organizmalardan elde edilen ekstremozimlere olan ilgiyi arttırmaktadır. Özellikle günümüzde artan ve giderek daha ulaşılabilir hale gelen DNA dizi analizi ve metagenomik çalışmalar ekstremozimlerin keşfini arttırmaya başlamıştır. Yeni organizma ve enzim keşfinde mikroorganizma üzerinden gitmenin getirdiği zorluklar, bütün ekstremofilik organizmaların iyi bilinmiyor oluşu veya laboratuvar ortamında kültürlenememesi gibi problemler metagenomik yaklaşımla üstesinden gelinebilir hale gelmiştir. Özellikle“shotgun metagenom”sayesinde organizmalar laboratuvarda kültürlenmeden rekombinant üretim için istenilen hedef protein dizisi rahatlıkla bulunabilmekte ve üretilebilmektedir. Ekstrem koşullardaki organizmalar, çok yüksek ve düşük sıcaklıklar, yüksek ve düşük pH, tuz, basınç ve ağır metal konsantrasyonları gibi koşullara adapte olmuş, onların proteinleri olan ekstremozimler ise benzer şekilde ekstrem ortama uygun olarak amino asit dizileri ve tercihleri, hidrojen bağları, tuz köprüleri, hidrofobik veya yüklü yüzey veya enzim merkezleri bulundurmaları ve çeşitli etkileşimler sayesinde adapte olmaktadır. Bu adaptasyonlar ekstremozimlerin endüstriyel kullanım açısından da potansiyellerinin ne kadar fazla olduğunu, çok zor koşullara dayanabileceklerini ve hatta protein mühendisliği uygulamalarıyla termal stabilite ve dayanıklılıklarının arttırılmasıyla kullanım alanlarının daha da genişletilmesini hedefleyen çok fazla çalışma vardır. Sitokrom P450 enzimleri, yaşamın her dalında bulunan, arke, bakteri ve ökaryotlarda çok çeşitli reaksiyonları gerçekleştirebilen, hem-tiyol monooksijenaz sınıfı enzimlerdir. P450'lerin merkezinde bir hem demiri bulunur ve altı tane koordinasyon bağı yapmaktadır. Bunlardan dördü içe dönük nitrojen atomlarıyla olmakla beraber, beşinci bağ sistein ile, altıncı bağ ise dinlenme durumundaki enzim için su molekülleriyledir. Bu protoporfirin yapısındaki sistein kalıntısı, hem demiri ile yaptığı bağ sayesinde oldukça stabildir ve P450'lerin çeşitli karakteristik özellikleri demirin yapmış olduğu bağlara ve spin durumuna göre değişmektedir. Dinlenme durumundaki P450 için spektral tarama yapılırsa 416-420 nm arasında bir pik gözlemlenebilir ve bu pik“Soret maksimum”olarak bilinir, bunun yanı sıra substrat bağlanması 420 nm pikini 390 nm civarına çeker, bu durum demirin düşük spin durumundan yüksek spin durumuna geçmesi olarak bilinmektedir. P450'lerin aktiflik durumu da benzer bir şekilde tespit edilebilmektedir. P450'lere karbonmonoksit gazı verildiğinde, enzimin altıncı koordinasyon noktasındaki su molekülü çıkar ve aktif olan enzim için afinitesi yüksek olan karbonmonoksit bağlanır ve 450 nm'de bir pik gözlemlenir, bu P450'lerin isminin de kökenini oluşturur. P450'ler bütün yaşam dallarında bulunmakla beraber yapı ve redoks partnerlerine göre farklı sınıflara bölünmektedirler ve çok fazla sayıda aile ve alt aileler bulunmaktadır. P450'ler yüksek regio- ve stereoselektivite'ye sahip olmalarının yanı sıra çok fazla biyotransformasyon gerçekleştirebilme kapasitesine sahiptirler. En yaygın ve bilinen reaksiyonları hidroksilasyon reaksiyonu olmasına rağmen, epoksidasyon, dealkilasyon, sulfoksidasyon ve anti-Markovnikov oksidasyonu gibi çok geniş bir reaksiyon yelpazesi bulunmaktadır. Farklı sınıflardan bazıları, örneğin bu tez çalışmasının da odağı olan CYP102 ailesi,“kendi kendine yetebilen”olarak bilinen ve dışsal ilave redoks partnerine ihtiyaç duymayan, redoks partnerlerini aynı polipeptit zinciri üzerinden sentezleyen üyeleri bulunmaktadır. Özellikle kendi kendine yetebilen P450'lere başka protein partnerleri gerektirmeden, sadece NAD(P)H gibi bir elektron donöründen elektron alarak reaksiyon gerçekleştirebilmeleri sayesinde hem bilimsel hem de endüstriyel olarak büyük bir ilgiyle yaklaşılmaktadır. CYP102'ler üç domainden oluşmaktadır; Flavin mononükleotidi (FMN), Flavin adenin dinükleotidi (FAD) ve monooksijenaz P450 hem domainidir. Elektron donörü olan NAD(P)H elektron verdiğinde FAD, FMN ve en son hem elektronu alır ve reaksiyonu katalizler. En çok çalışılan P450'lerden biri 102 ailesinden CYP102A1 (BM3)'dir. Yüksek katalizleme hızı ve veriminin yanı sıra çok fazla protein mühendisliği uygulamaları sayesinde yapı-fonksiyon ilişkisi ortaya çıkarılmış ve oldukça iyi karakterize edilmiş bir P450 üyesidir. Bu tez çalışmasında ekstrem ortamlardan elde edilerek metagenomik yaklaşımlarla yeni tanımlanmış 102 ailesine ait iki sitokrom P450'nin rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu hedeflenmiştir. Enzimlerden biri Antarktika'da King George Adası'ndan elde edilen CYP102A177 iken, diğeri Balıkesir'in Hisaralan bölgesindeki hidrotermal kaynak suyundan elde edilerek tanımlanmış CYP102A178'dir. Metagenomik yaklaşımla elde edilerek tanımlanan bu enzimlerde çoklu dizi hizalaması yapıldığında CYP102A178'nin hem bağlama bölgesinde bulunan, türler arasında fazlasıyla korunmuş ve“hem domaininin”fonksiyon ve stabilitesiyle ilişkisi olan sisteinin yerine tirozin olduğu gözlemlenmiştir. Normal şartlar altında bu sistein kalıntısı hem bağlanma bölgesinde karakteristik bir motif üzerinde bulunur ve bahsedildiği gibi tiyol bağı ile“hem demirinin”koordinasyon bağlarından birini oluşturur. Bu motifin CYP102A178'de değişmiş olması enzimin aktivite ve katlanmasını nasıl etkilediği,“doğal olmayan”nadir bir P450'ye mi ait olduğu yoksa metagenomik bir sekanslama hatası mı bulunduğu tirozinin sisteine çevrilmesiyle değişmiş olan hem yapısının geri getirilip getirilmediğine odaklanılmıştır. Tirozin amino asidi sisteine çevrildiğinden çalışılan mutanta CYP102A178 Y440C adı verilmiş, karşılaştırma yaparken daha kolay anlaşılabilmesi adına da orijinal sekansa sahip P450 ise CYP102A178 WT olarak belirtilmiştir. CYP102A178 WT için öncellikle sadece doğru katlanma ve aktivite deneyleri yapılacağından yüksek verim ve hacimde üretime gerek olmaması sebebiyle indüksiyon koşullarının optimize edilmesi gerekliliğinin de aşılmasından, otoindükleyen besiyeri kullanılmıştır. CYP102A178 WT üretildikten sonra kobalt ve nikel afiniteleri denerek saflaştırılmaya çalışılmıştır ancak her iki koşul için de saflaştırma denemeleri başarısız olmuştur, holoproteindense sadece“P450 hem domaininin”çok daha baskın bir şekilde üretildiği, holoproteinin ise çok az olduğu gözlemlenmiştir ancak spektral tarama ve CO-bağlanma testleri yapılmıştır. Spektral taramasında Soret maksimum değerinin 424 nm yani karakteristik bir Soret'e göre kırmızı spektral kaymaya uğradığı gözlemlenmiştir, CO-bağlanma deneyinde ise 450 nm'de herhangi bir pik gözlemlenmemiştir, sadece P420 inaktif form bulunmaktadır. CYP102A178 WT ile yapılan aktivite çalışmaları enzimin aktif durumda olmadığını, metagenomik sekanslamada bir hata olduğunu ortaya koymuştur, ilerleyen karakterizasyon çalışmalarına aktivitesi kanıtlanmış Y440C mutantı ile devam edilmiştir. CYP102A177 ve CYP102A178 Y440C için biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapılacağından yüksek verimde rekombinant üretim gerekmektedir. Bu bağlamda, tez çalışmasında bu iki enzim için ekspresyon optimizasyonu küçük ölçekte farklı indüksiyon dereceleri, saatleri ve IPTG konsantrasyonları denenerek Western blot ile kontrol edilmiş, en yüksek üretim kapasitesine sahip olan koşullar için büyük ölçekte üretime devam edilmiştir. CYP102A178 Y440C için yapılan ilk optimizasyon çalışmasında holoenzimi baskılayacak derecede fazla P450 hem ve FAD-FMN domainlerinin ayrı ayrı ekspresyonu veya proteaz ile parçalanmaları gözlemlenmiş olduğundan farklı koşullarda ikincil bir optimizasyon süreci yapılmıştır. CYP102A177 için 20 °C, 20 saat, 1 mM IPTG, CYP102A178 Y440C için ise 25 °C, 12 saat, 0,4 mM IPTG en uygun ve yüksek verime sahip ekspresyon koşulları olarak belirlenmiştir. CYP102A177 ve CYP102A178 Y440C içinse yüksek hacimde rekombinant üretim yapılmış ve HiTrap Talon kolonlarıyla FPLC'de saflaştırılmışlardır. Saflaştırılan proteinler daha sonrasında biyokimyasal karakterizasyonda kullanılmıştır. Tampon çözelti değişimi ve konsantre edilmenin ardından spektral tarama yapıldığında iki enzimin de Soret maksimumu 418 nm'de gözlenmiş, CO-bağlanma testinde çok az P420, domine edecek şekilde, yüksek miktarda P450 formu gözlemlenmiştir. Aktif protein olduğu doğrulandıktan sonra, iki enzim için de dairesel dikroizm ile termal stabilite testleri yapılmıştır. Termofilik olan CYP102A178 Y440C için termal erime sıcaklığı 68,22 °C, soğuk adaptif CYP102A177 için ise 53 °C olduğu gözlemlenmiştir. CYP102A178 Y440C ve CYP102A177 için pH ve tuz stabilite testleri yapılmış 72 ve 48 saatlik inkübasyonlarda enzim stabilitesi takip edilmiştir. 3'ten 10'a kadar denenen pH'larda CYP102A178 Y440C'nin pH 7'den 10'a kadar neredeyse hiç enzim kaybı olmadığı, CYP102A177'de ise çok az olduğu, 7'nin altındaki asidik pH'larda dahi enzim kaybının her iki enzim için de %50'den fazla olmadığı tespit edilmiştir. Tuz stabilitesi için 0, 0,5, 1, 2 ve 3 M NaCl ile benzer bir deney yapılmış ve CYP102A178 Y440C için en stabil 0 ve 0,5 M NaCl'de olduğu gözlemlenmiş olmasına rağmen, yüksek tuz konsantrasyonlarında dahi her iki enzimde de enzim kaybının %50'den fazla olmadığı ve tuz toleransının da çok yüksek olduğu belirlenmiştir. Literatürde iyi karakterize edilmiş CYP102'ler genellikle yağ asitlerini substrat olarak seçtiklerinden iki enzim için de ilk olarak yağ asitleri denenmiştir; substrata bağlanma ile demirin yüksek spin durumuna geçmesi, 390 nm'ye mavi spektral kayma olarak beklenmektedir. İki enzim için de yapılan birincil substrat taramalarında direkt olarak 390 nm'ye, yüksek spin durumuna bir kayma gözlemlenmemiştir. Ancak her iki enzim için de oleik, miristoleik, palmitoleik ve linoleik asitler normal Soret maksimum değerinden 414 nm'ye mavi bir spektral kayma göstermektedir, bunlar potansiyel substratlar olabileceği için titrasyon reaksiyonlarının kurulması hedeflenmektedir. CYP102A178 Y440C için kurulan titrasyonlardan linoleik asit için ayrışma sabiti (KD) değeri 254,5 µM olarak hesaplanmış ve düşük afiniteyle bağlama gösterdiği gözlemlenmiştir. İleriki çalışmalarda her iki enzim için de farklı konsantrasyon ve substratların da denenmesi ve substrat havuzunun terpen, terpenoid ve stereoidlere genişletilmesi planlanmaktadır. Substratların belirlenmesinin ardından HPLC ve GC-MS ile ürün analizleri bu çalışma sonrasında amaçlanmakta ve bu şekilde biyoteknolojik potansiyellerinin, hangi endüstrilerde nasıl kullanılabileceklerinin çözülmesi hedeflenmektedir. Son olarak yapısal farklılıklara bakmak için in silico analizlerle, iki enzimin yüzey yükleri ve tuz köprüleri kıyaslanmış, CYP102A177'nin daha nötral bir yüzeye sahip olduğu ve daha açık ve esnek bir konformasyonda bulunduğu gözlemlenirken, CYP102A178 Y440C daha sıkışmış bir yapıya sahip olup daha çok negatif yüklü amino asitlerle yüzeyinin domine olduğu ve neredeyse iki katı kadar tuz köprüsü bulundurduğu gözlemlenmiştir. Bunlar aslında literatürde de bulunan ekstremozimlerin ortamlarına adapte olmak için oluşturduğu değişimlerdir ve in vitro biyokimyasal analizlerde gösterilen CYP102A178 Y440C'nin CYP102A177'ye kıyasla neden ve nasıl daha yüksek termal, tuz ve pH stabilitesine sahip olduğunu gösterir niteliktedir. Bu çalışma ile, WT ile Y440C kıyaslanarak beşinci koordinasyon noktasındaki sisteinin hem'in yapısı ve fonksiyonelliği üzenindeki öneminin gösterilmesinin yanı sıra, ekstrem koşulların aynı aileye mensup iki P450 enziminin yapı ve biyokimyasal özelliklerini nasıl etkilediği gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

Enzymes are biomolecules capable of performing a wide variety of transformations by lowering the activation energy of the chemical reactions. Their high regio- and stereoselectivity make them an environmentally friendly alternative in industrial applications, in which production with chemical means and reactions could be challenging, expensive, or produce too many intermediate or waste products. Although non-protein enzymes, such as ribozymes, also exist in nature, enzymes are mostly known to be proteins. Despite the great interest in enzymes due to their high specificity and functions, industrial applications often involve very harsh operating conditions. Requirements such as very high or low temperatures, extreme salt and pH levels, or sensitivity to various chemicals used in industrial applications, limit the usage of enzymes. The inability of enzymes to withstand these operating conditions has led to an increased interest in extremozymes, especially those obtained from extremophilic organisms. Particularly with the increasing availability of DNA sequencing and advancements in metagenomic studies, the discovery of novel extremozymes has begun to increase. The challenges of discovering new organisms and novel enzymes through microorganisms, such as the fact that not all extremophilic organisms are well studied or that they cannot be cultured in laboratory environment, can be overcome with the metagenomic approaches. Especially with shotgun metagenomics, the desired target protein sequence for recombinant production can be easily found and produced without culturing organisms in the laboratory. Organisms in extreme conditions, such as very high and low temperatures, high and low pH, salt, pressure conditions and heavy metals, have adapted to these conditions, and by means of that, they have very high tolerance to harsh conditions. Their proteins, extremozymes, similarly adapt to these extreme environments through amino acid sequences and preferences, hydrogen bonds, salt bridges, hydrophobic or charged surfaces, or active site core, and various interactions they have optimized. These adaptations highlight the significant potential of extremozymes for industrial use, their ability to withstand very harsh conditions, and there are numerous studies aiming to expand their applications by increasing their thermostability and durability through protein engineering applications in the literature. Cytochrome P450 enzymes are a class of heme-thiolate monooxygenases found in all domains of life, capable of carrying out a wide variety of reactions in archaea, bacteria, and eukaryotes. At the center of P450s, a heme iron molecule forms six coordination bonds. Four of these are with inward facing nitrogen atoms, the fifth bond is with cysteine, and the sixth bond is with water molecules in the resting state of the enzyme. In this protoporphyrin ring structure, the cysteine residue is quite stable due to its thiolate bond with the heme iron, and various characteristic properties of P450s vary accordingly with the bonds formed by the iron and its spin state. A spectral scan of the resting P450 reveals a characteristic peak between 416 and 420 nm, known as the Soret maximum. Substrate binding shifts this 420 nm peak to around 390 nm, indicating a shift of the iron from a low to a high spin state. The activity status of P450s can be determined similarly. When carbon monoxide gas is introduced to P450s after they are reduced, the water molecule at the enzyme's sixth coordination site is removed, and carbon monoxide, which has a high affinity for the active enzyme, binds, resulting in a peak at 450 nm, which is the origin of the name“P450s”. P450s are found in all branches of life and are divided into different classes according to their structure and redox partners, with a large number of families and subfamilies. P450s possess high regio- and stereoselectivity, as well as the capacity to carry out many biotransformations. Although their most common and well-known reaction is hydroxylation, they have a very wide range of reactions, including epoxidation, dealkylation, sulfoxidation, and anti-Markovnikov oxidation. Some of the different classes, such as the CYP102 family, which is the focus of this thesis, have members that are known to be“self-sufficient”and do not require any external redox partners, synthesizing their redox partners from the same polypeptide chain. Self-sufficient P450s, in particular, are attracting great interest both scientifically and industrially due to their ability to react by accepting electrons from an electron donor such as NAD(P)H, without requiring other protein partners. CYP102s consist of three domains: flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), and the monooxygenase P450 heme domain; they are naturally fusion proteins. One of the most studied P450s is CYP102A1 (BM3) from the 102 family. It is a highly characterized P450 member whose structure-function relationship has been revealed thanks to its high catalytic rate and efficiency, as well as numerous applications in protein engineering for the aim of increasing its stability. Within the scope of this thesis, two novel cytochrome P450 enzymes from the 102 family, identified from extreme environments using metagenomic approaches. One enzyme is CYP102A177, obtained from King George Island in Antarctica, while the other is CYP102A178, identified from hydrothermal spring water in the Hisaralan region of Balıkesir. Multiple Sequence Alignment of these enzymes revealed that CYP102A178 has tyrosine instead of cysteine in its heme binding domain. This cysteine residue is highly conserved across species and is associated with the function and stability of the heme domain, as mentioned earlier. Under usual conditions, this cysteine residue is located on a characteristic and signature motif in the heme binding domain and, forms one of the coordination bonds of heme with a thiolate bond. The study focused on how the alteration of this motif in CYP102A178 affects the enzyme's activity and structure, whether it belongs to a rare“non-canonical P450”, or whether it is a metagenomic sequencing error, and whether the heme structure, altered by the conversion of tyrosine to cysteine back, is changing the functionality. Since the tyrosine amino acid is converted to cysteine, the mutant was named as CYP102A178 Y440C, while the P450 with the original sequence was designated as CYP102A178 WT for easier comparison. For CYP102A178 WT, since only activity experiments were to be conducted initially, high yield and volume production was not required, and for eliminating the need to optimize induction conditions, an autoinducing medium was used. After CYP102A178 WT was produced, attempts were made to purify it by testing its cobalt and nickel affinities, but purification attempts failed for both conditions. It was observed that only the“P450 heme domain”was produced in a much more dominant way than the holoprotein itself, while the holoprotein expression was very low. However, spectral scanning and CO-binding tests were performed. In spectral scanning, the Soret maximum value was observed at 424 nm, indicating a red shift compared to a characteristic and usual Soret, while in the CO-binding test, no peak was observed at 450 nm; only the inactive P420 form was present. Activity studies with CYP102A178 WT revealed that the enzyme was not active, indicating an error in metagenomic sequencing in the first place. Further characterization studies were continued with the Y440C mutant, which has proven its activity. High-yield recombinant production is required for biochemical characterization studies of CYP102A177 and CYP102A178 Y440C; to compare how different extremities affect biochemical and structural properties of two P450s from the same family. Within this context, in this thesis study, the expression optimization for these two enzymes was checked on a small scale by testing different induction degrees, times, and IPTG concentrations using Western blot initially, and recombinant production was continued on a large scale for the conditions with the highest production capacity. In the first optimization study performed for CYP102A178 Y440C, the expression of P450 heme and FAD-FMN domains observed separately as several bands on Western blot in excessive amounts to the point of suppressing the holoenzyme, a secondary and further optimization process was carried out under different conditions. For CYP102A177, 20 °C, 20 hours, 1 mM IPTG, and for CYP102A178 Y440C, 25 °C, 12 hours, 0.4 mM IPTG were determined as the most suitable and high-yield expression conditions. For CYP102A177 and CYP102A178 Y440C, high-volume recombinant production was performed and purified by FPLC using HiTrap Talon columns. The purified proteins were then used for biochemical characterization. After buffer exchange and concentration of proteins, spectral scanning revealed that both enzymes showed a Soret maximum at 418 nm as expected, and in the CO-binding test, very little P420 was observed, with a high amount of P450 form predominating. After confirmation of active protein and correct folding, thermal stability tests were performed for both enzymes by using Circular Dichroism. The thermal melting point for the thermophilic CYP102A178 Y440C was observed to be 68.22 °C, while for the cold-adaptive CYP102A177 it was 53 °C. pH and salt stability tests were performed for both CYP102A178 Y440C and CYP102A177, and enzyme stability was monitored after 72 and 48 hours of incubation by measuring their remaining Soret maximum. At pH values ranging from 3 to 10, it was determined that CYP102A178 Y440C showed no enzyme loss from pH 7 to 10, while CYP102A177 showed very little loss. Even at acidic pH values below 7, enzyme loss did not exceed 50% for either enzyme, exhibiting very broad range of pH stability. A similar experiment was conducted with 0, 0.5, 1, 2, and 3 M NaCl to test salt stability, and although the most stable concentrations for CYP102A178 Y440C were observed at 0 and 0.5 M NaCl, it was determined that even at high salt concentrations up to 3 M NaCl, enzyme loss did not exceed 50% in both enzymes, and salt tolerance of both of the enzymes was very high. Since most well-characterized CYP102s in the literature generally choose fatty acids as substrates, fatty acids were tested first for both of them; the transition of iron from low to a high spin state upon substrate binding is expected to be represented by a blue spectral shift to 390 nm. In initial substrate scans, no direct shift to a high spin state at 390 nm was observed at all. However, for both enzymes, oleic, myristoleic, palmitoleic, and linoleic acids show a subtle blue spectral shift from normal Soret maximum to 414 nm, and since these could be potential substrates, the goal was establishing titration reactions. From the titrations performed for CYP102A178 Y440C, the dissociation constant (KD) for linoleic acid was calculated as 254.5 µM, and it was observed to bind with low affinity to the enzyme. Further studies are planned to test different concentrations and substrates for both enzymes and to expand the substrate pool to include terpenes, terpenoids, and steroids, especially considering the metagenomic origins of these two enzymes. Following the identification of substrates, product analyses using HPLC and GC-MS are planned after this study, aiming to determine their biotechnological potential and how they can be used in various industries. Finally, in silico analyses were performed to examine structural differences, comparing the surface charges and salt bridges of the two enzymes. It was observed that CYP102A177 has a more neutral surface and a more open and flexible conformation as expected, while CYP102A178 Y440C has a more compact structure, its surface is dominated by negatively charged amino acids mostly, and it has almost twice as many salt bridges. These are actually changes that extremozymes undergo to adapt to their environments, as also found in the literature, and in vitro biochemical analyses show why and how CYP102A178 Y440C has higher thermal, salt, and pH stability compared to CYP102A177. This study demonstrates the importance of cysteine at the fifth coordination site on the structure and functionality of heme by comparing WT and Y440C, as well as showing how extreme conditions affect the structure and biochemical properties of two P450 enzymes belonging to the same family.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    961846

    Yeni bir rekombinant fungal kitinazın heterolog ekspresyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu

    Heterologous expression and biochemical characterization of a novel recombinant fungal chitinase

    ABDULSAMET ÖZDEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    BiyoteknolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ GÜNSELİ KURT GÜR

  2. Tez No

    685679

    Recombinant production and characterization of matrix metalloproteinases- 1 and -13 for treatment of macular corneal dystrophy

    Matriks metalloproteinaz -1 ve -13'ün maküler kornea distrofisi tedavisi için rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    SANİYE GÜL KAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GÖKHAN KARAKÜLAH

    DR. SİBEL KALYONCU UZUNLAR

  3. Tez No

    740030

    Recombinant production and characterization of chitinase enzyme from Pseudomonas mandelii KGI_MA19

    Pseudomanas mandelii KGI_MA19 organızmasına ait kitinaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EMİNE TUĞÇE SARAÇ CEBECİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Mikrobiyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  4. Tez No

    813551

    Development of methods for the production and analysis of novel recombinant proteins with potential anti-infective properties

    Potansiyel anti-enfektif özellikleri olan yeni rekombinant proteinlerin üretimi ve analizi için yöntemlerin geliştirilmesi

    AMİNE YÜCEKUL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiKonya Gıda ve Tarım Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DR. ÖĞR. ÜYESİ GÜLCİHAN GÜLSEREN

  5. Tez No

    439439

    Metisilin dirençli Staphylococcus aureus'dan rekombinant lipaz üretimi, karakterizasyonu ve immobilizasyonu

    Recombinant lipase production, characterization and immobilization from methicillin resistant Staphylococcus aureus

    AİŞE ÜNLÜ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyokimyaGebze Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AZİZ TANRISEVEN

    PROF. DR. AYHAN ÇELİK

Geri Dön