Development of immunoaffinity enrichment techniques for measurement of gfap protein in serum by id-lc-ms/ms method
Serumda gfap proteininin ıd-lc-ms/ms yöntemi ile ölçümü için immünoafinite zenginleştirme tekniklerinin geliştirilmesi
- Tez No: 1016020
- Danışmanlar: DOÇ. DR. MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biyokimya, Biology, Biotechnology, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Nörolojik hastalıkların yol açtığı ölüm ve engellilik oranları, küresel ölçekte kritik bir halk sağlığı sorunu teşkil etmekte ve bu durumun önümüzdeki yıllarda daha da artacağı öngörülmektedir. Özellikle yaşlanan nüfusla birlikte Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), multipl skleroz (MS), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve travmatik beyin hasarı (TBI) gibi nörolojik bozuklukların görülme sıklığında belirgin bir artış beklenmektedir. Bu hastalıklarda, geri dönüşü olmayan nörolojik hasar oluşmadan önce uygulanacak erken müdahaleler, hastalığın ilerlemesini yavaşlatabilmekte ve hasta yaşam kalitesini önemli ölçüde artırabilmektedir. Ancak günümüzde birçok nörolojik hastalığın kesin tanısı, klinik semptomların belirgin hale gelmesinden sonra konulabilmektedir. Semptomların ortaya çıktığı aşamada ise çoğu zaman nöronal kayıp ve doku hasarı ileri seviyeye ulaşmış olmaktadır. Bu nedenle, hastalık süreçlerini erken dönemde yansıtabilecek, güvenilir, hassas ve standardize edilmiş biyobelirteçlere olan ihtiyaç giderek artmaktadır. Son yıllarda merkezi sinir sistemi kaynaklı biyobelirteçler üzerine yapılan çalışmalar, nörolojik hastalıkların tanı ve takibinde önemli ilerlemeler sağlamıştır. Bu biyobelirteçler arasında Glial Fibriller Asidik Protein (GFAP), özellikle astrosit hasarı ve nöroinflamasyonun göstergesi olması nedeniyle dikkat çekmektedir. GFAP, merkezi sinir sistemindeki astrositlerin ana ara filaman proteinidir ve tip III ara filaman protein ailesinde yer almaktadır. Hücre iskeletinin korunması, hücresel mekanik dayanıklılığın sağlanması, hücre şeklinin sürdürülmesi ve kan-beyin bariyerinin (BBB) bütünlüğünün desteklenmesinde önemli görevler üstlenmektedir. Normal fizyolojik koşullarda GFAP büyük ölçüde merkezi sinir sistemi içerisinde sınırlı kalırken; travma, iskemi, inflamasyon veya nörodejenerasyon gibi patolojik durumlarda astrositler“reaktif astrogliyozis”olarak tanımlanan bir süreçten geçmekte ve GFAP ekspresyonu belirgin şekilde artmaktadır. Kan-beyin bariyerinin bozulmasıyla birlikte GFAP beyin dokusundan periferik dolaşıma geçebilmekte ve serum veya plazmada ölçülebilir hale gelmektedir. Bu özellikleri nedeniyle GFAP, hem akut beyin hasarının hem de kronik nörodejeneratif süreçlerin değerlendirilmesinde umut vadeden bir biyobelirteç olarak kabul edilmektedir. GFAP düzeylerinin özellikle travmatik beyin hasarı, inme, glioblastoma, Alzheimer hastalığı ve diğer nörodejeneratif bozukluklarda arttığı çeşitli klinik çalışmalarda gösterilmiştir. Ayrıca GFAP seviyelerinin hastalık şiddeti, prognoz ve tedavi yanıtı ile ilişkili olabileceği bildirilmiştir. Bu nedenle GFAP'ın klinik kullanım potansiyeli giderek önem kazanmaktadır. Günümüzde serum GFAP ölçümleri ağırlıklı olarak enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA), elektrokemilüminesans tabanlı yöntemler ve tek molekül dizisi (SIMOA) gibi yüksek hassasiyetli immünolojik tekniklerle gerçekleştirilmektedir. Yüksek hassasiyetli immünolojik yöntemler GFAP ölçümünde yaygın olarak kullanılsa da, yöntemler arası standardizasyon eksikliği önemli bir problem oluşturmaktadır. Özellikle farklı üreticilere ait kitlerde kullanılan antikorların hedef epitoplarının değişkenlik göstermesi, sonuçların karşılaştırılabilirliğini azaltmaktadır. Ayrıca kalibrasyon materyallerinin standardize olmaması, ölçümlerin SI birimlerine doğrudan izlenebilirliğini sınırlandırmaktadır. Bu durum farklı laboratuvarlar arasında ölçüm uyumsuzluklarına yol açabilmekte ve klinik karar süreçlerini etkileyebilmektedir. Klinik karar süreçlerinde güvenilir sonuçlar elde edebilmek için ölçümlerin uluslararası standartlarla uyumlu olması ve SI (Uluslararası Birimler Sistemi) izlenebilirliğinin sağlanması büyük önem taşımaktadır. Bu noktada ISO 17511 standardı, in vitro tanı testlerinde metrolojik izlenebilirliğin sağlanması açısından temel gereklilikleri tanımlamaktadır. Bu tez çalışmasının temel amacı, GFAP ölçümlerinde metrolojik izlenebilirlik zincirinin oluşturulmasına katkı sağlayacak, SI izlenebilirliğine sahip aday bir Referans Ölçüm Prosedürü'nün (RMP) geliştirilmesidir. Bu amaç doğrultusunda ilk aşamada rekombinant insan GFAP proteini başarıyla üretilmiş ve saflaştırılmıştır. GFAP geninin uygun ekspresyon sistemi kullanılarak rekombinant protein üretimi gerçekleştirilmiş, ardından polihistidin (His-tag) etiketi taşıyan protein immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) yöntemi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma sürecinde proteinlerin saflık düzeyleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile değerlendirilmiş ve hedef proteinin yüksek saflıkta elde edildiği doğrulanmıştır. Elde edilen yüksek saflıktaki GFAP proteini, geliştirilecek referans yöntemde kalibrasyon materyali ve analitik doğrulama amacıyla kullanılmıştır. Tez kapsamında geliştirilen referans ölçüm yaklaşımı, yüksek doğruluk ve seçicilik sağlayan İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometresi (ID-LC-MS/MS) temeline dayanmaktadır. Kütle spektrometrisine dayalı referans ölçüm prosedürleri, yüksek analitik seçicilikleri ve moleküler düzeyde tanımlama yetenekleri nedeniyle klinik metrolojide altın standart yaklaşımlar arasında değerlendirilmektedir. İzotop seyreltme stratejisi, örnek hazırlama ve iyonizasyon süreçlerinden kaynaklanabilecek değişkenlikleri minimize ederek yüksek doğruluk sağlamaktadır. Özellikle protein biyobelirteçlerinin kantitatif analizinde stabil izotop işaretli standartların kullanılması, analitik güvenilirliği artırmaktadır. Bu nedenle ID-LC-MS/MS yaklaşımı, GFAP gibi düşük konsantrasyonlu proteinlerin standardize ölçümünde güçlü bir aday yöntem olarak öne çıkmaktadır. ID-LC-MS/MS yöntemleri, protein biyobelirteçlerinin SI izlenebilir ölçümü açısından günümüzde en güvenilir analitik platformlardan biri olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, serum matrisi yüksek protein içeriği ve düşük hedef analit konsantrasyonları nedeniyle önemli analitik zorluklar içermektedir. Özellikle GFAP'ın serumdaki pikogram düzeyindeki düşük konsantrasyonu, doğrudan analizleri zorlaştırmaktadır. Bu nedenle çalışmada, GFAP'ın serumdan seçici olarak zenginleştirilmesi amacıyla immünoafinite tabanlı bir örnek hazırlama stratejisi uygulanmıştır. Bu doğrultuda manyetik nanoparçacıklar üzerine anti-GFAP antikorlarının immobilizasyonu optimize edilmiştir. Yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda, 1 mg manyetik nanoparçacığa 100 μg antikor bağlanmasının uygun olduğu belirlenmiştir. Ayrıca sentezlenen antikor-manyetik boncuk kompleksinden 1 mL serum örneği için 10 μL kullanılmasının GFAP zenginleştirmesi açısından yeterli olduğu tespit edilmiştir. Bu immünozenginleştirme yaklaşımı sayesinde serum matriksindeki girişimlerin azaltılması ve hedef proteinin daha seçici şekilde elde edilmesi amaçlanmıştır. Zenginleştirilen örneklerde proteolitik sindirim sonrası hedef peptitler LC-MS/MS sistemi ile analiz edilmiştir. Analitik yöntem geliştirme sürecinde GFAP proteinini temsil eden dört hedef peptit seçilmiştir: LEAENNLAAYR, ALAAELNQLR, FADLTDAAAR ve LADVYQAELR. Bu peptitler için kromatografik ayrım, geçiş optimizasyonları ve kantitatif analiz parametreleri ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir. Geliştirilen ID-LC-MS/MS metodu sonucunda seçilen peptitlerin nicel belirleme sınırı (LOQ) sırasıyla 0.3, 0.93, 0.77 ve 0.78 μg/L olarak belirlenirken, algılama sınırı (LOD) değerleri sırasıyla 0.93, 2.79, 2.31 ve 2.33 μg/L olarak hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar, yöntemin seçicilik ve tekrarlanabilirlik açısından başarılı performans gösterdiğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, mevcut kütle spektrometrisi teknolojisinin hassasiyet limitleri ve serum matriksinin karmaşıklığı nedeniyle, geliştirilen yöntemin duyarlılığı sağlıklı bireylerde veya erken evre nörodejeneratif hastalıklarda gözlenen pikogram/mL düzeyindeki GFAP konsantrasyonlarını ölçmek için henüz yeterli seviyeye ulaşmamıştır. Buna rağmen çalışmada geliştirilen yaklaşım, SI izlenebilirliğine dayalı olması nedeniyle önemli bir metodolojik altyapı sunmakta ve aday referans ölçüm yöntemi niteliği taşımaktadır. Özellikle immünolojik yöntemlerin harmonizasyonu ve standardizasyonu açısından böyle bir referans yöntemin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Gelecekte yapılacak çalışmaların örnek hazırlama süreçlerinin geliştirilmesi, immünozenginleştirme veriminin artırılması ve yeni nesil yüksek hassasiyetli kütle spektrometrisi sistemlerinin kullanılması üzerine yoğunlaşması önerilmektedir. Özellikle daha yüksek afiniteye sahip monoklonal antikorlar, aptamer tabanlı yaklaşımlar ve optimize edilmiş kromatografik iş akışları sayesinde matriks kaynaklı girişimlerin azaltılması ve düşük seviyeli GFAP'ın daha hassas şekilde tespit edilmesi mümkün olabilir. Ayrıca geliştirilen referans yöntemin geniş ölçekli klinik örneklerde uygulanması, mevcut immünolojik yöntemlerle karşılaştırılması ve farklı nörolojik hastalıklardaki klinik performansının değerlendirilmesi gerekmektedir. Sonuç olarak, bu tez çalışması, GFAP biyobelirteci için rekombinant protein üretiminden başlayarak immünozenginleştirme, analitik yöntem geliştirme ve aday referans ölçüm yaklaşımına kadar uzanan kapsamlı bir çalışma sunmaktadır. Çalışma kapsamında geliştirilen ID-LC-MS/MS tabanlı yaklaşım, nörolojik biyobelirteçlerin standardizasyonuna yönelik önemli bir altyapı oluşturmasının yanı sıra, klinik laboratuvarlarda gelecekte uygulanabilecek referans sistemlerin geliştirilmesine katkı sağlamaktadır. Özellikle SI izlenebilirliğine sahip referans ölçüm prosedürlerinin geliştirilmesi, farklı ölçüm platformları arasında harmonizasyon sağlanmasına yardımcı olabilir. Böylece hasta sonuçlarının laboratuvardan bağımsız olarak karşılaştırılabilir hale gelmesi mümkün olacaktır. Ayrıca geliştirilen yaklaşımın yalnızca GFAP için değil, diğer nörodejeneratif hastalık biyobelirteçleri için de uyarlanabilir bir metodolojik temel sunabileceği düşünülmektedir.
Özet (Çeviri)
The high rates of mortality and disability caused by neurological diseases represent a significant global public health concern, with a further increase in the coming decades. In conditions like Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), and traumatic brain injury (TBI), early and accurate diagnosis is essential for the timely interventions that can help slow down disease progression. However, the definitive diagnosis of many neurological disorders often occurs only after symptoms have significantly advanced, which severely restricts the window for effective treatment. Overcoming this challenge requires developing reliable, accessible biomarkers that directly reflect disease pathology. In this context, Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), a major structural component of astrocytes in the central nervous system (CNS), emerges as a particularly promising candidate. As a type III intermediate filament protein, GFAP is essential for preserving cellular structure, offering mechanical support, and managing the blood-brain barrier (BBB). When the CNS experiences trauma, ischemia, or degeneration, astrocytes undergo reactive changes known as“astrogliosis,”characterised by increased GFAP production. Furthermore, when the integrity of the blood-brain barrier is disrupted, GFAP can leak into the peripheral bloodstream, where it can be detected, serving as a specific marker for the severity of brain injury and prognosis. Currently, GFAP measurement in serum primarily relies on immunoassays like Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Single-Molecule Array (SIMOA). However, ensuring SI (International System of Units) traceability in accordance with ISO 17511 standards is a clinical necessity to achieve harmonization and comparability between these methods. In this thesis, to establish a foundation for the metrological traceability chain, recombinant human GFAP protein was successfully expressed and obtained at high purity using chromatographic techniques. The purification of the polyhistidine-tagged protein was carried out using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC), and the quality of the purification was confirmed through Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Using this purified protein, the study aimed to develop a candidate Reference Measurement Procedure (RMP) via Isotope Dilution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (ID-LC-MS/MS). This approach intends to fill the existing gap in the traceability chain by directly linking patient results to SI units. To overcome low protein concentrations and matrix complexity in serum, an immunoaffinity (IA) enrichment strategy using antibody-magnetic-bead complexes was employed. Optimization experiments determined that binding 100 μg of antibody to 1 mg of magnetic nanoparticles was optimal, and utilizing 10 μl of this synthesized complex was sufficient for GFAP enrichment from 1 ml of serum. Following these optimizations, the developed ID-LC-MS/MS method produced Limits of Quantification (LOQ) of 0.3, 0.93, 0.77, and 0.78 μg/L, and Limits of Detection (LOD) of 0.09, 0.28, 0.23, and 0.23 μg/L for the four selected peptides (LEAENNLAAYR, ALAAELNQLR, FADLTDAAAR, LADVYQAELR), respectively. Although the current sensitivity levels—limited by existing mass spectrometry capabilities and the complexity of the serum matrix—are insufficient to measure picogram levels found in healthy individuals or in early-stage neurodegeneration, the established SI traceability indicates that this method serves as a strong candidate reference measurement procedure, crucial for developing certified reference materials. Future research should focus on improving analytical sensitivity and selectivity through advancements in sample preparation, enrichment efficiency, and instrumental performance. In particular, the use of more efficient immunoenrichment strategies, highly selective affinity binders such as next-generation monoclonal antibodies or aptamers, and optimized chromatographic workflows may further reduce matrix interference and enhance low-level GFAP detection in serum. Furthermore, it is recommended to apply this candidate reference method to large-scale clinical samples to compare it with existing immunoassays and to fully demonstrate the clinical applicability of GFAP for early diagnosis and monitoring of disease using standardized data. In conclusion, this thesis standardizes the entire process from GFAP production to reference measurement, establishing a strategic academic foundation for a reference measurement system compatible with international standards for the diagnosis of neurological diseases.
Benzer Tezler
- Kütle spektrometrisi ile proteinlerin ubikitinasyon bölgelerinin düşük derişimlerde belirlenmesi
Determination of ubiquitination site of proteins at low concentrations by mass spectrometry
ÜLKÜ GÜLER TOKAT
- Proteomic approaches for the identification and quantification of clinically relevant biomarkers
Klinik önem taşıyan biyobelirteçlerin belirlenmesi ve miktar tayini için proteomik yaklaşımlar
MELTEM AŞICIOĞLU KÜÇÜK
Doktora
İngilizce
2024
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
DR. MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
- Development of immunoaffinity based detection platforms for food pathogens
Gıda patojenleri için immünoafinite temelli teşhis platformlarının geliştirilmesi
DİLEK ÇAM
Doktora
İngilizce
2016
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
- Elektrokimyasal hibrit afinite elektrotların geliştirilmesi ve genel tarama kiti olarak kullanılabilirliklerinin araştırılması
Development of electrochemical hybrid affinity electrodes and evaluation of their usability as general screening kits
TUNCA KARASU
- Effect of different anti-aflatoxin antibody isotypes on biosensor and immunoaffinity column performance
Aflatoksine karşı geliştirilen farklı izotipli antikorların biyosensör ve immunoaffinite kolon performansları üzerine etkileri
ÖZLEM ERTEKİN
Doktora
İngilizce
2016
BiyokimyaGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZAFER ZİYA ÖZTÜRK
