Geri Dön

Proteomic approaches for the identification and quantification of clinically relevant biomarkers

Klinik önem taşıyan biyobelirteçlerin belirlenmesi ve miktar tayini için proteomik yaklaşımlar

PDF İndir

  1. Tez No: 901600
  2. Yazar: MELTEM AŞICIOĞLU KÜÇÜK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER, DR. MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyoloji, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 115

Özet

Kardiyovasküler hastalıklar dünya genelinde insanları etkileyen önemli bir sağlık sorunudur. Bu hastalıkların erken teşhisi, özellikle kalp krizi gibi durumların başarılı bir şekilde tedavi edilmesi ve ölüm riskinin azaltılması açısından hayati önem taşır. Kardiyak troponin I (cTnI), kalp krizi tanısı ve risk değerlendirmesinde önemli bir biyobelirteçtir. cTnI'nın sağlıklı bireylerde kandaki seviyesi 45 nanogram/litrenin altında bulunur. Ancak kalp krizi sırasında ve sonrasındaki süreçte, kalbin hasar görmesi nedeniyle kana salınarak seviyesi artar. cTnI, kanda üçlü kompleks (cTnC-cTnT-cTnI), ikili kompleks (cTnI-cTnC) ve serbest formlar gibi farklı yapılarla tespit edilebilir. Bu biyobelirteç, proteoliz ve enzimatik değişikliklere oldukça duyarlıdır; dolayısıyla proteolize uğramış, fosforile olmuş, oksitlenmiş ve indirgenmiş cTnI formlarının çeşitli varyasyonları kanda bulunabilir. Piyasada birçok cTnI testi bulunmaktadır. Kanda dolaşan farklı varyasyonlar, cTnI'ın farklı epitoplarına özgü farklı monoklonal antikorlar tarafından tanınabilir. Bütün bu değişkenler, cTnI ölçümleri arasında farklılıklar ortaya çıkmasına sebep olur. Kardiyak troponin I'nın çeşitli versiyonları ve kullanılan farklı antikorlar, ticari testler arasındaki farklılıkları on katından fazla arttırmıştır, ancak kitlerin standardizasyonu zordur. Laboratuvarlar, kullanılan testlerin farklılığı nedeniyle farklı klinik karar eşikleri uygulamaktadır. Bu değişkenlik, hekimlerin cTnI sonuçlarını yanlış yorumlamalarına neden olabilir. Bu nedenle cTnI testlerinin standardizasyonu aciliyet taşımaktadır. Uluslararası Klinik Laboratuvar Sonuçlarının Harmonizasyonu Konsorsiyumu (ICHCLR), cTnI testlerinin standardizasyonu ve/veya harmonizasyonunu yüksek öncelikli bir konu olarak ele almaktadır. ISO 17511'e göre, bir maddenin ölçümünün standartlaştırılması için, metrolojik izlenebilirlik zincirine gereksinim vardır. Bu zincir, birincil referans ölçüm prosedürü ile başlar, bu prosedür birincil bir referans malzemeye (RM) miktar değeri atar. Birincil RM'ler, ikincil RM'ye değer atamak için kullanılır. Bu ikincil RM'ler ile hastane örneklerinde rutin olarak ölçülen biyobelirteci ölçebilmek için, çalışma ve ürün kalibratörlerine değerler atanır. Bu izlenebilirlik zinciri, hasta için rapor edilen değerlerin uluslararası birimler sistemine (SI) kadar izlenebilmesine olanak sağlar. Bu şekilde, metrolojik izlenebilirlik, rutin ölçüm sonuçlarının uzun vadeli kararlılığını ve karşılaştırılabilirliğini destekler. cTnI ölçümünün standartlaştırılması ya da uyumlaştırılması için, RM'lere ve referans ölçüm prosedürlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Uluslararası Klinik Kimya ve Laboratuvar Tıbbı Federasyonu Troponin I Standartlaştırma Çalışma Grubu (IFCC WG-TNI) tarafından önerilen izlenebilirlik zinciri, bu standartlaştırma unsurlarının tamamını kapsar. IFCC çalışma grubunun odaklandığı ana görevlerden biri, üst düzey bir referans ölçüm prosedürünün geliştirilmesidir. Bu tezde, cTnI biyobelirtecinin referans ölçüm prosedürünün geliştirilmesini desteklemek amacıyla iki farklı analitik yöntem çalışılmıştır. Her iki analitik prosedür de hedefe yönelik ve aşağıdan-yukarıya proteomik yaklaşımlarını içermektedir. cTnI'nın mutlak miktarını belirlemek için, her iki yöntemde de izotop-seyreltme kütle spektrometrisi (IDMS) kullanılmıştır. ID-MS yöntemiyle protein miktar tayininde iki farklı strateji uygulanmıştır: protein-tabanlı kalibrasyon stratejisi ve peptit-tabanlı kalibrasyon stratejisi. Her iki yöntemin de kendine özgü avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. İlk geliştirilen analitik metot, protein-tabanlı bir kalibrasyon stratejisi ile cTnI'yı insan serumundan tayin etmeyi sağlar. Bununla ilgili olarak, insan kardiyak troponin kompleks materyali (NIST SRM 2921) kalibrant olarak kullanılmak üzere seçilmiştir. İç standart olarak da, cTnI ile aynı dizilime sahip ancak izotopik olarak etiketli cTnI proteini kullanılmıştır. Serum gibi karmaşık bir matristen cTnI'yı yakalayabilmek için, immunoaffinite zenginleştirme stratejisi kullanılmıştır. Immunoaffinite zenginleştirmenin ilk adımı olarak, mikro (Dynabeads® MyOne™ ,1 m) ve nano (Nanomag®-D, 130 nm) olarak iki farklı boyuta sahip manyetik parçacıklar seçilmiştir. cTnI proteinine bağlanabilen bir monoklonal antikor, her iki manyetik nanoparçacığa immobilize edilerek, cTnI'yı zenginleştirme verimleri karşılaştırılmıştır. Manyetik nanoparçacık (Nanomag®-D, 130 nm) kullanılarak, cTnI'ya ait seçilen iki triptik peptit pik alanları görece daha yüksek tespit edildiği için, manyetik nanoparçacık ilerleyen deneyler için seçilmiştir. Daha sonra, manyetik nanoparçacığın maksimum yükleme kapasitesi belirlenmiştir. Buna göre, 1 mg parçacığa 100 g antikor eklendiğinde, 59.2 ± 5.7 μg/mg antikor bağlanabildiği bulunmuştur. Sentezlenen nanoparçacık-antikor kompleksi kullanılarak, 1 ml serumdan cTnI zenginleştirmesi için gereken miktar hesaplanmış ve analiz için 1 ml serumdaki cTnI'nin tamamının eldesi için, 10 μl kompleksi kullanımının yeterli olduğu tespit edilmiştir. Optimizasyonlar sonucunda geliştirilen protein-tabanlı kalibrasyon stratejisini kullanan izotop seyreltme kütle spektrometrisi tandem kütle spektrometrisi (ID-LC-MS/MS) metodu, cTnI'nın 0,6 ile 24 μg/L arasında (R > 0.996) ölçülebilmesini sağlar. Tayin sınırı (LOQ) 1,8 μg/L ve algılama sınırı (LOD) 0,6 μg/L olarak belirlenmiştir. Ara kesinlik %9,6'nın altında ve tekrarlanabilirlik tüm kalite kontrol materyalleri için %2,0-%8,7 arasında bulunmuştur. Analiz edilen kalite kontrol materyallerinin doğruluğu %90-110 arasındadır. Toplam ölçüm belirsizlikleri (n=6), tüm seviyeler için %12,5'in altında bulunmuştur. İkinci geliştirilen ID-LC-MS/MS metodu, peptit-tabanlı bir kalibrasyon stratejisi ile cTnI'yı insan serumundan tayin etmeyi sağlar. Bu metotta kalibrant olarak, cTnI'ya ait iki triptik peptit (TLLLQIAK and NITEIADLTQK) seçilmiş ve sentetik olarak elde edilmiştir. İç standart olarak, seçilen peptitlerin izotopik versiyonları kullanılmıştır. Peptit safsızlık düzeltme amino asit (PICAA) analizi ile sentetik peptitlere değer ataması gerçekleştirilmiş ve böylece SI-izlenebilir birincil peptit standartları üretilmiştir. cTnI proteininin tam kesimini sağlamak ve proteoliz verimini artırmak için, tripsin kesim yöntemleri, enzim-protein oranı ve kesim süresi gibi optimizasyonlar yapılmıştır. En iyi tripsin kesim verimi, Filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) yöntemi kullanılarak, 1:10 enzim-protein oranında ve gece boyunca kesim ile elde edilmiştir. Peptit-tabanlı kalibrasyon yaklaşımında aynı zamanda, kalibrasyon eğrisini oluşturmak için iki vekil matris kullanılmıştır. İki vekil matris, doğrusallık, doğruluk, tekrarlanabilirlik, ara kesinlik ve gerçeklik gibi parametrelere göre değerlendirilmiştir. Her iki matrisin de benzer sonuçlar verdiği gözlemlenmiş ve performanslarının tutarlı olduğu tespit edilmiştir. Geliştirilen peptit-tabanlı kalibrasyon stratejisini kullanan analitik yöntem, cTnI'nin 0.6–21.6 μg/L aralığında ölçülebilmesini sağlar. Ara kesinlik %28.9'un altında, tekrarlanabilirlik tüm konsantrasyon seviyelerinde %10'un altında bulunmuştur. Geri kazanım oranı, %72 ile %151 arasında değişkenlik göstermektedir. Kalp krizi şüphesiyle hastaneye getirilen dört hasta serumu, geliştirilen metot ile ölçülmüş, immunoassay ile alınan sonuçlar arasında %50'den fazla farklılık bulunmuştur. Son olarak, peptit bazlı kalibrasyon stratejisi ve protein bazlı ölçüm stratejisi metot performansları bakımından karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, bu tezde hedefli ve aşağıdan-yukarıya proteomik yöntemleri kullanarak, iki farklı ID-LC-MS/MS metodu geliştirilmiştir. Her iki metot da birbirleriyle verimlilik açısından karşılaştırılmıştır. Bu çalışmalar, metroloji topluluğunun yeni yaklaşımları benimsemesini ve belirli ihtiyaçlara göre uyarlanmış, SI izlenebilir peptit ve protein birincil standartları ile referans prosedürlerin geliştirmesini desteklemeyi amaçlamaktadır. Geliştirilen yöntemlerin, dış kalite değerlendirme materyalleri ve ikincil referans malzemelerde (RM) cTnI konsantrasyonunun belirlenmesinde referans ölçüm prosedürü olarak hizmet etme veya referans ölçüm prosedürünün geliştirilmesine katkıda bulunma potansiyeli bulunmaktadır. Laboratuvarlar arası cTnI standardizasyonu ve uyumlaştırılması son derece karmaşık bir süreçtir. Ancak, IFCC WG-TNI, cTnI ölçümünün standartlaştırılabilir olduğuna inanmaktadır. Kardiyak troponin I'nın hasta yönetimindeki kritik rolü göz önüne alındığında, bu alandaki büyük çaba kesinlikle değerlidir. Önerilen ölçüm yöntemleri, IFCC WG-TNI'nın faaliyetlerini desteklemekte önemli bir rol oynayacaktır.

Özet (Çeviri)

Cardiovascular diseases are a significant health issue affecting people worldwide. Early diagnosis of cardiovascular diseases is crucial for the successful treatment of conditions such as heart attacks and for preventing death. Cardiac troponin I (cTnI) is a vital biomarker for the diagnosis and risk assessment of heart attacks. In healthy individuals, cTnI levels are found below 45 nanograms per liter. During and in the hours following a heart attack, it is released into the blood stream due to heart tissuedamage, leading to an increase in its levels. cTnI can be detected in the blood in various forms, including a ternary complex (cTnC-cTnT-cTnI), a binary complex (cTnI-cTnC), and free forms. It is highly susceptible to proteolysis and enzymatic changes. Consequently, various forms of cTnI, including proteolyzed, phosphorylated, oxidized, and reduced forms, can be found in the blood. All these variables lead to differences in cTnI measurements. There are many cTnI tests available on the market. The different variations circulating in the blood can be recognized by different monoclonal antibodies specific to different epitopes of cTnI. The various versions of cTnI, along with the different antibodies used, have increased the correlations between commercial tests more than tenfold, yet standardization remains challenging. Laboratories use different clinical decision thresholds depending on the test used. Different assay cutoffs have the potential to confuse physicians, leading to the misinterpretation of cTnI results; hence, there is urgency for cTnI standardization. The standardization and/or harmonization of cTnI assays is considered a high priority by the International Consortium for Harmonization of Clinical Laboratory results (ICHCLR). According to ISO 17511, the standardization of the measurement of a biomarker requires a metrological traceability chain. This chain begins with a primary reference measurement procedure (RMP), which assigns quantity values to a primary reference material (RM). Primary RMs are used to assign values to a secondary RM. With this secondary RM, values are assigned to working and product calibrators for routine quantification of the biomarker in patient samples. This traceability chain allows the values reported for patient care to be traced back to the International System of Units (SI). In this way, metrological traceability supports the long-term stability and comparability of routine laboratory measurement results. The standardization or harmonization of cTnI measurement requires the development of RMs and RMPs. The traceability chain proposed by the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine Working Group on Standardization of Troponin I (IFCC WG-TNI) incorporates all these standardization steps. One of the tasks that the IFCC working group is focused on to establish the proposed traceability chain is the development of a higher-order RMP. In this thesis, the focus has been on developing two different analytical methods to support the development of a RMP. Both analytical procedures involve targeted and bottom-up proteomic approaches. In both methods, isotope dilution mass spectrometry (IDMS) has been used to determine the absolute amount of cTnI. For quantifying proteins using the IDMS method, two different strategies have been employed: the protein-based calibration strategy and the peptide-based calibration strategy. Each method has its own advantages and disadvantages. The first developed analytical method allows for the determination of cTnI from human serum using a protein-based calibration strategy. In this context, human cardiac troponin complex material (NIST SRM 2921) has been selected for use as a calibrant. The troponin complex was purified from human heart tissue and consists of three subunits: troponin T (cTnT), troponin I (cTnI), and troponin C (cTnC). As an internal standard, isotopically labeled cTnI protein with the same sequence as cTnI has been used. To extract cTnI from a complex matrix like serum, an immunoaffinity enrichment strategy has been employed. As the first step of immunoaffinity enrichment, two different diameters of magnetic particles were selected: micro (Dynabeads® MyOne™, 1 μm) and nano (Nanomag®-D, 130 nm). A monoclonal antibody capable of binding to cTnI was immobilized on both types of magnetic nanoparticles, and their cTnI enrichment efficiencies were compared. Magnetic nanoparticles (Nanomag®-D, 130 nm) were chosen for further experiments because the peak areas of two selected tryptic peptides of cTnI were relatively higher. Next, the maximum loading capacity of the magnetic nanoparticles was determined. It was found that when 100 μg of antibody was added to 1 mg of particles, 59.2 ± 5.7 μg/mg of antibody could be bound. Using the synthesized nanoparticle-antibody conjugate, the required amount for cTnI enrichment from 1 ml of serum was calculated, and it was determined that 10 μl of conjugate was sufficient to capture all cTnI in 1 ml of serum for analysis. As a result of these optimizations, the isotope dilution liquid chromotograpy tandem mass spectrometry (ID-LC-MS/MS) method using the developed protein-based calibration strategy allows the measurement of cTnI in the range of 0.6 to 24 μg/L (R > 0.996). The limit of quantification (LOQ) was determined to be 1.8 μg/L, and the limit of detection (LOD) was 0.6 μg/L. Intermediate precision was found to be below 9.6%, and repeatability ranged from 2.0% to 8.7% for all quality control materials. The accuracy of the analyzed quality control materials was between 90% and 110%. Total measurement uncertainties (n=6) were found to be below 12.5% for all levels. The second developed ID-LC-MS/MS method allows the determination of cTnI in human serum using a peptide-based calibration strategy. In this method, two tryptic peptides (TLLLQIAK and NITEIADLTQK) of cTnI were selected and synthesized as calibrants. Isotopically labeled versions of the selected peptides were used as internal standards. Peptide impurity correction amino acid (PICAA) analysis was performed to assign values to the synthetic peptides, thereby producing SI-traceable primary peptide standards. Peptide-based calibration approach also employed two surrogate matrices to construct the calibration curve. The surrogate matrices were evaluated based on parameters such as linearity, accuracy, repeatability, intermediate precision, and trueness. It was observed that both matrices yielded similar results, indicating consistency in their performance. To ensure complete cleavage of the cTnI protein and enhance proteolysis yield, optimizations such as trypsin digestion methods, enzyme-to-protein ratio, and digestion time were performed. The best trypsin cleavage yield was obtained using the Filter-Aided Sample Preparation (FASP) method with a 1:10 enzyme-to-protein ratio and overnight digestion. The developed analytical method using the peptide-based calibration strategy enables the quantitative determination of cTnI in the range of 0.6–21.6 μg/L. Intermediate precision RSD was less than 28.9%, and repeatability RSD was less than 10% across all concentration levels. The recovery rate ranged between 72% and 151%. Four patient serum samples with suspected heart attack were measured using the developed method, and the results showed discrepancies of more than 50% compared to those obtained with immunoassay. Finally, the performance of the peptide-based calibration strategy was compared with the protein-based measurement strategy. In conclusion, this thesis has developed two different ID-LC-MS/MS methods using a targeted and bottom-up proteomic approaches. Both methods were compared with each other in terms of effectiveness. This efforts aim to support the metrology community in adopting new approaches and developing SI-traceable peptide and protein primary standards and/or reference procedures tailored to specific needs. Standardization and harmonization of cTnI across laboratories are undeniably complex tasks. However, the IFCC WG-TNI believes that cTnI measurement is standardizable. Given the critical role of cTnI in patient management, the significant effort invested is worthwhile. The proposed measurement methods will play a role in supporting the activities of the IFCC WG-TNI. These studies are necessary and logical steps towards the harmonization of results obtained from different test kits.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    887071

    A deep learning architecture for missing metabolite concentration prediction

    Eksik metabolit miktarı tahmini için bir derin öğrenme mimarisi

    SADİ ÇELİK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİstanbul Teknik Üniversitesi

    Bilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ALİ ÇAKMAK

  2. Tez No

    688030

    Behavior of alpha-2-macroglobulin unique peptides in biological samples

    Biyolojik numunelerde alfa-2-makroglobülin özgün peptitlerinin davranışı

    PELİN YILDIZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    KimyaOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SÜREYYA ÖZCAN KABASAKAL

  3. Tez No

    383345

    Proteomics of Phanerochaete chrysosporium under heavy metal stress

    Ağır metal stresi altında Phanerochaete chrysosporıum'un proteomiği

    VOLKAN YILDIRIM

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

  4. Tez No

    662696

    Discovery of novel enzymes using proteomic approaches

    Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi

    MERVE ÖZTUĞ KILINÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ

  5. Tez No

    531078

    Systems biomedicine and pharmacology approaches for drug repositioning to uncover candidate anti-cancer drugs

    Aday kanser karşıtı ilaçların bulunması için sistem biyotıp ve farmakolojisi yaklaşımı ile ilaç repozisyonu

    BESTE TURANLI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyomühendislikMarmara Üniversitesi

    Biyomühendislik Bilim Dalı

    DOÇ. DR. KAZIM YALÇIN ARĞA

Geri Dön