Geri Dön

Pulmoner arteriyel hipertansiyon patogenezinde rolü olduğu düşünülen aday genlerin fonksiyonel analizi

Functional analysis of candidate genes considered to play a role in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension

PDF İndir

  1. Tez No: 1019436
  2. Yazar: ECEM İNCİ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NESLİHAN ÇOBAN, DR. ÖĞR. ÜYESİ GÖZDE KORKMAZ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Genetik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH) pulmoner arter vazokonstriksiyonu ve yeniden modellenmesi ile karakterizedir. Önceki çalışmamızda genç yaşta idiyopatik PAH (İPAH) tanısı alan bir hastada, patojenik olduğu tahmin edilen, hastalık patogenezinde rol oynayabilecek biyolojik yolaklarda görev alan, yeni ve nadir SMAD5 ve SLIT2 varyantları tüm ekzom dizileme ile heterozigot durumda saptanmıştır. Ayrıca, SMAD5 ekspresyonunun İPAH olgularında azaldığı gözlenmiştir. Bu tez çalışmasında, saptanan erken sonlandırma kodonu oluşturan SMAD5:c.694C>T, p.Gln232* ve yanlış anlamlı SLIT2:c.2852G>A, p.Gly951Glu varyantlarının yol açabileceği olası moleküler değişikliklerin PAH patogenezindeki potansiyel rolünün in vitro olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Varyantların etkileri patojenite tahmin araçları kullanılarak in silico değerlendirilmiştir. Sanger dizileme ile aile segregasyonu yapılmış ve ailede SMAD5 mRNA ekspresyonu incelenmiştir. In vitro çalışmalarda, HEK293T hücreleri kullanılarak CRISPR/Cas9 yöntemiyle SMAD5 knock-out (KO) modelinin oluşturulması için çalışmalar gerçekleştirilmiş, wild-type (WT) hücrelerde siRNA aracılı SLIT2 baskılanması ve BMP-4 stimülasyonu sağlanmıştır. BMP- 4 uygulamasının hücre canlılığı üzerindeki etkisi CCK-8 testi ile değerlendirilmiştir. Oluşturulan hücre kültürü koşullarında kantitatif gerçek zamanlı PCR ile SLIT2 ve reseptörü ROBO1, BMP reseptörü BMPR2, R-SMAD ailesi üyeleri (SMAD1, SMAD5 ve SMAD8), ortak SMAD olan SMAD4 ile BMP sinyal yolunun aşağı akış hedefleri olan ID1 ve ID3 genlerinin mRNA ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Ayrıca, Western blot ile SMAD5, fosforile SMAD5 (pSMAD5) ve aktif BMP sinyalizasyonunu gösteren fosforile SMAD1/5/8 (pSMAD1/5/8) protein kompleksi anlatım düzeyleri incelenmiştir. In silico analizlerde her iki varyant patojenik sınıflandırılmış ve SLIT2 varyantının protein stabilitesini azalttığı, SMAD5 varyantının ise anlamsız kodon aracılı mRNA yıkımına sebep olacağı öngörülmüştür. SMAD5 üzerindeki bu etki probanda ait cDNA örneğinin Sanger dizilemesiyle doğrulanmıştır. SMAD5 varyantı proband dışında dört aile üyesinde heterozigot olarak saptanırken SLIT2 varyantı yalnızca probandda saptanmıştır. Ailede varyant taşıyan dört bireyde taşımayanlara kıyasla SMAD5 ekspresyonunun azaldığı belirlenmiştir. In vitro çalışmalarda, SMAD5 KO modeli için oluşturulan altı farklı kolonide başlangıçta mRNA anlatımında %46 ile %87 arasında ve protein anlatımında %57 ile %92 arasında baskılanma belirlenmiş ancak bu baskılanmanın uzun dönemde stabilite gösteremediği saptanmıştır. WT HEK293T hücrelerinde siRNA uygulaması ile SLIT2 gen ifadesinin %69 oranında baskılanması sağlanmıştır. BMP-4 uygulaması ile ID1 ve ID3 genlerinin ifadelerinin arttığı belirlenmiş ve yolağın aktivasyonu doğrulanmıştır. SLIT2 ifadesinin baskılanması ile BMPR2 gen anlatım düzeyinin arttığı, bunun yanında baskılama yapılan hücrelerde BMP-4 uygulaması ile SMAD1 ve SMAD8 ekspresyonlarının ilgili kontrollere göre artış gösterdiği belirlenmiştir. Yalnızca BMP-4 uygulanan koşulda SMAD8 gen ifadesinin kontrole göre arttığı saptanmıştır. SLIT2 geninin baskılandığı koşullarda SMAD5, pSMAD5, pSMAD1/5/8 protein seviyelerinin ve pSMAD5/total SMAD5 oranını azaldığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, SLIT2 baskılanmasına bağlı SMAD5 protein düzeyi ve R-SMAD fosforilasyonundaki azalma, SLIT2 proteininin BMP/SMAD sinyal yolunda düzenleyici bir rol üstlendiğini ve SMAD5 varyantı ile birlikte yalnızca probandda gözlenen ağır PAH fenotipini açıklayabilecek ortak bir moleküler mekanizmayı desteklemektedir.

Özet (Çeviri)

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by pulmonary arterial vasoconstriction and vascular remodeling. In our previous study, novel and rare heterozygous variants in SMAD5 and SLIT2, predicted to be pathogenic and involved in biological pathways potentially associated with disease pathogenesis, were identified by whole-exome sequencing in a patient diagnosed with idiopathic PAH (IPAH) at a young age. In addition, SMAD5 expression was observed to be decreased in IPAH cases. This thesis aimed to evaluate the potential roles of the molecular alterations caused by the identified premature termination codon-forming SMAD5: c.694C>T, p.Gln232* variant and missense SLIT2:c.2852G>A, p.Gly951Glu variant in PAH pathogenesis using in vitro functional analyses. The effects of the variants were evaluated in silico using pathogenicity prediction tools. Family segregation analysis was performed by Sanger sequencing, and SMAD5 mRNA expression was examined in family members. For the in vitro studies, HEK293T cells were subjected to CRISPR/Cas9-mediated editing and single-cell cloning to establish a SMAD5 knockout (KO) model. In wild-type (WT) HEK293T cells, siRNA-mediated SLIT2 silencing and BMP- 4 stimulation were performed. The effect of BMP-4 treatment on cell viability was evaluated using the CCK-8 assay. Under the established cell culture conditions, mRNA expression levels of SLIT2 and its receptor ROBO1, the BMP receptor BMPR2, members of the R-SMAD family (SMAD1, SMAD5, and SMAD8), the common SMAD, SMAD4, and the downstream targets of the BMP signaling pathway, ID1 and ID3, were analyzed by quantitative real-time PCR. In addition, protein levels of SMAD5, phosphorylated SMAD5 (pSMAD5), and phosphorylated SMAD1/5/8 (pSMAD1/5/8), indicating active BMP signaling, were evaluated by Western blot. In silico analyses classified both variants as pathogenic. The SLIT2 variant was predicted to decrease protein stability, whereas the SMAD5 variant was predicted to cause nonsensemediated mRNA decay. This predicted effect on SMAD5 was confirmed by Sanger sequencing of cDNA obtained from the proband. The SMAD5 variant was detected in the heterozygous state in four family members in addition to the proband, whereas the SLIT2 variant was detected only in the proband. SMAD5 expression was found to be decreased in the four variant-carrying family members compared with non-carriers. In the in vitro studies, six different colonies generated for the SMAD5 KO model initially showed 46–87% reduction in mRNA expression and 57–92% reduction in protein expression; however, this reduction was found not to be stable in the long term. In WT HEK293T cells, SLIT2 expression was successfully silenced by 69% following siRNA treatment. BMP-4 treatment increased ID1 and ID3 expression, confirming pathway activation. SLIT2 silencing increased BMPR2 gene expression. In addition, in SLIT2-silenced cells, BMP-4 treatment increased SMAD1 and SMAD8 expression compared with their respective controls. SMAD8 expression was also increased in the BMP-4-only condition compared with the control. Under SLIT2-silenced conditions, SMAD5, pSMAD5, and pSMAD1/5/8 protein levels, as well as the pSMAD5/total SMAD5 ratio, were decreased. In conclusion, the reduction in SMAD5 protein levels and R-SMAD phosphorylation following SLIT2 silencing suggests that SLIT2 may have a regulatory role in the BMP/SMAD signaling pathway. Together with the SMAD5 variant, this finding supports a shared molecular mechanism that may contribute to the severe PAH phenotype observed only in the proband.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    858735

    Pulmoner arteriyel hipertansiyon hastalarında spesifik tedavi öncesi bakılan sistemik immün inflamasyon indeksinin mortaliteyi öngörmedeki yeri

    Systemic immun inflammatoir index: As a new predictor of mortality in precapillary pulmonary hypertension patients before administiration of spesific treatment

    CEM UTKU YEŞİLKAYA

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    KardiyolojiAydın Adnan Menderes Üniversitesi

    Kardiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HASAN GÜNGÖR

  2. Tez No

    914962

    Sistemik skleroz hastalarında serum FGF-23 ve klotho düzeylerinin karotis intima media kalınlığı ile ilişkisi

    Serum FGF-23 and klotho levels in systemic sclerosis patientsrelationship with carotid intima media thickness

    ASLI BOZDEMİR

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    İç HastalıklarıPamukkale Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VELİ ÇOBANKARA

  3. Tez No

    247327

    Pulmoner arteriyal hipertansiyon tedavisinde kullanılan İloprost, Bosentan ve Sildenafil'in etkilerinde vasküler endoteliyal büyüme faktörünün rolü

    Role of vascular endothelial growth factor in effects of Iloprost, Bosentan and Sildenafil that are used in treatment of pulmonary arterial hypertension

    SEMRA YİĞİTASLAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2009

    Eczacılık ve FarmakolojiEskişehir Osmangazi Üniversitesi

    Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BAŞAR SIRMAGÜL

  4. Tez No

    336665

    Pulmoner arteriyel hipertansiyonu olan çocuklarda serum Fraktalkin, İnterlökin 6 ve C reaktif protein düzeyleri

    Serum Fractalkine, Interleukin 6 and C-reactive protein levels in children with pulmonary arterial hypertension

    GÖKÇEN ÖZ TUNÇER

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıGazi Üniversitesi

    Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATMA RANA OLGUNTÜRK

  5. Tez No

    150372

    Pulmoner embolide ACE gen polimorfizmi sıklığı

    The frequency of ACE gen polymorhism in pulmonary embolism

    BUKET ALTINOK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2004

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. NEJAT AKAR

Geri Dön