CRISPR prime editing ile OPTN genindeki splice-site mutasyonuna yönelik in-vitro düzeltme yaklaşımının etkinlik ve verimlilik analizi
Analysis of the efficiency and efficacy of an in vitro CRISPR prime editing–based correction approach targeting a splice-site mutation in the OPTN gene
- Tez No: 1021649
- Danışmanlar: DOÇ. DR. NADİR KOÇAK
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Selçuk Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Prime Editing (PE), CRISPR-Cas tabanlı genom düzenleme teknolojileri arasında, çift iplikli DNA kırığı oluşturmadan ve düşük hedef dışı yan etki ile yüksek özgüllükle hedef nükleotid değişikliklerine olanak sağlayan yeni nesil bir yaklaşımdır. Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), motor nöronların progresif kaybı ile seyreden, tedavi seçenekleri sınırlı, yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır. ALS tip 12 (ALS12), OPTN genindeki patojenik varyantlar ile ilişkilidir. Bu tez çalışmasında, OPTN geninde yer alan c.1242+1G>A splice-site varyantının, hastadan elde edilen primer fibroblast hücrelerinde PE2 yöntemi ile in vitro olarak düzeltilmesinin etkinlik ve verimliliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmada, OPTN:c.1242+1G>A varyantını hedefleyen özgün bir epegRNA tasarımı in silico olarak gerçekleştirilmiştir. EpegRNA dizileri Golden Gate klonlama yöntemi ile pU6-GG-acceptor vektörüne klonlanmış ve Cas9-nickaz–reverse transkriptaz içeren pCMV-PEmax plazmidi ile hastadan elde edilen primer fibroblast hücrelerine Lipofektamin aracılı transfeksiyon uygulanmıştır. Ayrıca kullanılan OPTN:c.1242+1G>A_eGFP-epegRNA ve pCMV-PE2-tagRFP-BleoR plazmitleri sayesinde transfeksiyon başarısı GFP ve RFP floresan markerlar ile doğrulanmıştır. Prime Editing sonrası genomik DNA izolasyonu yapılmış, hedef bölge amplifiye edilerek yeni nesil dizileme (NGS) ile analiz edilmiştir. Düzenleme verimliliği, yüksek derinlikli dizileme verilerinin Integrative Genomics Viewer (IGV) üzerinden sayısal olarak değerlendirilmesi ile hesaplanmıştır. Çalışma ilgili etik kurul onayı ve hastadan alınan bilgilendirilmiş onam doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Bulgular: NGS analizleri sonucunda, OPTN:c.1242+1 pozisyonunda hedeflenen A>G düzeltmesinin farklı transfeksiyon havuzlarında yaklaşık %0,07–%0,41 arasında değişen oranlarda gerçekleştiği saptanmıştır. Biyolojik duplikat uygulanan deney havuzlarında benzer düzenleme oranlarının elde edilmesi, sonuçların tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Artan plazmid dozları ile düzenleme verimliliği arasında pozitif bir ilişki gözlenmiştir. GFP ve RFP pozitif hücrelerin saptanması transfeksiyonun başarıyla gerçekleştirildiğini doğrulamıştır. Sonuç: Bu tez çalışması, literatürde ilk kez OPTN genindeki c.1242+1G>A splice-site varyantının, hastadan elde edilen primer fibroblast hücrelerinde Prime Editing yöntemi ile hedeflenebileceğini göstermektedir. Elde edilen düzenleme oranları düşük olmakla birlikte PE teknolojisinin ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda hastaya özgü hücrelerde uygulanabilirliğini ortaya koymaktadır. Bu düzeltme, OPTN geninin normal splice mekanizmasının yeniden sağlanması açısından potansiyel terapötik önem taşımaktadır. Bulgular Prime Editing verimliliğinin optimizasyon çalışmalarının artırılması ve ileri düzey hücresel seçim stratejileri ile klinik uygulamalara taşınabileceğine işaret etmektedir.
Özet (Çeviri)
Objective: Prime Editing (PE) is a next-generation genome editing approach within CRISPR–Cas-based technologies that enables precise nucleotide modifications with high specificity without inducing double-strand DNA breaks and with reduced off-target effects. Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a devastating neurodegenerative disease characterized by progressive loss of motor neurons and limited therapeutic options. ALS type 12 (ALS12) is associated with pathogenic variants in the OPTN gene. In this thesis, we aimed to evaluate the efficiency and effectiveness of in vitro correction of the OPTN c.1242+1G>A splice-site variant using the PE2 system in patient-derived primary fibroblast cells. Materials and Methods: An original epegRNA targeting the OPTN c.1242+1G>A variant was designed in silico. The epegRNA sequences were cloned into the pU6-GG-acceptor vector using the Golden Gate cloning method and co-transfected with the Cas9 nickase–reverse transcriptase–containing pCMV-PEmax plasmid into patient-derived primary fibroblast cells via Lipofectamine-mediated transfection. In addition, the use of OPTN:c.1242+1G>A_eGFP-epegRNA and pCMV-PE2-tagRFP-BleoR plasmids enabled validation of transfection efficiency through GFP and RFP fluorescent markers. Following Prime Editing, genomic DNA was isolated, the target region was amplified, and next-generation sequencing (NGS) was performed. Editing efficiency was calculated by quantitative analysis of high-depth sequencing data using Integrative Genomics Viewer (IGV). The study was conducted in accordance with institutional ethics committee approval and informed consent obtained from the patient. Results: NGS analysis revealed that the targeted A>G correction at the OPTN:c.1242+1 position was achieved at frequencies ranging from approximately 0.07% to 0.41% across different transfection pools. Comparable editing rates observed in biologically duplicated experimental pools demonstrated the reproducibility of the results. A positive correlation was identified between increasing plasmid dosage and editing efficiency. The detection of GFP- and RFP-positive cells confirmed successful transfection. Conclusion: This thesis demonstrates for the first time that the OPTN:c.1242+1G>A splice-site variant can be targeted using Prime Editing in patient-derived primary fibroblast cells. Although the observed editing efficiencies were relatively low, the findings highlight the feasibility of applying PE technology in patient-specific cellular models for neurodegenerative diseases such as ALS. Importantly, this correction holds potential therapeutic relevance by enabling restoration of the normal splicing mechanism of the OPTN gene. The results suggest that further optimization of Prime Editing strategies and advanced cellular selection approaches may facilitate translation toward clinical applications.
Benzer Tezler
- A comparative evaluation of functional smn expression either with motor neuron-specific promoters or screening of crispr-prime editing associated pegrnas
Motor nöron-spesifik promotörler veya crispr-prime editing tabanlı pegrna'ların tarama yaklaşımı i̇le fonksiyonel smn ekspresyonunun karşılaştırmalı değerlendirmesi
SILA KULAÇ
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
BiyolojiÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CİHAN TAŞTAN
- Crıspr prıme edıtıng gen düzenleme yaklaşımları kullanılarak Survıval Motor Nöron-2 (SMN2) geni üzerindeki nokta mutasyonların onarım etkinliğinin araştırılması
Investigation of the repair efficiency of point mutations on the Survival Motor Neuron-2 (SMN2) gene using crispr prime editing gene editing approaches
ENES BAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Moleküler TıpÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
- Crıspr-prime editing yaklaşımının Spinal Musküler Atrofi in vitro modelinde off-target kapasitesinin, sitotoksisitesinin ve SMN protein ekspresyonunun stabilitesinin araştırılması
Investigation of off-target capacity, cytotoxicity, andstability of SMN protein expression of crispr-pe approach inSspinal Muscular Atrophy in vitro model
SİBEL PINAR ODABAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
GenetikÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
- Functional capabilities of lentiviral motor neuron-specific promoter driven SMN1 gene expression and SMN2 gene editing strategy using crispr-prime editing
Motor nöron-spesifik promotör kontrollü lentiviral smn1 gen ekspresyonunun ve crıspr-prime editing kullanılarak smn2 gen düzenleme stratejisinin fonksiyonel kapasiteleri
SEVGİ OLTAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
GenetikÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CİHAN TAŞTAN
- Prime editing teknolojisi kullanılarak kronik myeloid lösemi hücre hattında BCR-ABL füzyon geninin terapötik amaçlı düzenlenmesi
Therapeutic editing of the BCR-ABL fusion gene in chronic myeloid leukemia cell line using prime editing technology
BÜŞRA GÖKSEL TULGAR