Prime editing teknolojisi kullanılarak kronik myeloid lösemi hücre hattında BCR-ABL füzyon geninin terapötik amaçlı düzenlenmesi
Therapeutic editing of the BCR-ABL fusion gene in chronic myeloid leukemia cell line using prime editing technology
- Tez No: 986871
- Danışmanlar: DOÇ. DR. NADİR KOÇAK
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Selçuk Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Prime Editing (PE) yöntemi,CRISPR-Cas teknolojileri arasında yer alan, yüksek verimlilik ve seçilen diziye yüksek spesifiklik gösteren,gen düzenleme alanındaki yeni yaklaşımlardan biridir.Bu çalışmada K562 hücre dizisinde PE uygulanması ve bu doğrultuda Kronik Myeloid Lösemi (KML) hastalığının,BCR-ABL1 füzyon onkogeninde güncel yaklaşımlardan farklı bir yaklaşım denenerek genetik düzenleme ile hastalığın tedavisine yönelik gen terapi alanına yeni bir strateji sunulması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada KML patogenezinin temel mekanizması olan BCR-ABL1 füzyonunu hedefleyen özgün bir yöntem geliştirilmiştir.K562 hücre dizisi kullanılarak translasyonu sonlandıracak spesifik bir terminasyon sekansının BCR-ABL1 birleşim noktasına eklenmesi amaçlanmıştır.Öncelikle hedef bölge dizisi belirlenmiştir.Çalışmanın en spesifik parçası olan epegRNA molekülünün tasarımı yapılmıştır.Golden Gate Klonlama yöntemi kullanılarak epegRNA sentezi gerçekleştirilmiştir.epegRNA'nın vektöre ligasyonu gerçekleştirilmiştir.Transformasyon ve transfeksiyon işlemleri uygulanmıştır.PE verimlilik oranı,Yeni Nesil Dizileme (YND) yöntemi ile iki farklı ve birbirini tamamlayan biyoinformatik yaklaşım ile analiz edilmiştir.Öncelikle P2 primer seti ile toplam wild-type (WT) alel popülasyonu belirlenmiştir.Sonraki basamakta özel olarak tasarlanmış P3 primer seti ile sadece düzenlenmiş alellerin zenginleştirilerek çoğaltılması sağlanmıştır.YND'den elde edilen ham veriler,hem özel komut dosyalarıyla doğrudan sayılarak hem de özel oluşturulmuş referans dizilere hizalanarak Integrative Genomics Viewer (IGV) ile doğrulanmıştır. Bulgular: Düzenleme verimliliği,%10.64 olarak hesaplanmıştır.Standart YND analizinin, negatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yanlılığı nedeniyle düşük frekanslı düzenlemeleri tespit etmede yetersiz kaldığı gösterilmiştir.Bu sınırlılığı aşmak için,sadece düzenlenmiş alelleri zenginleştiren seçici bir PZR yaklaşımı uygulanmıştır.Bu sayede, düzenleme oranı hassas bir şekilde hesaplanmıştır.Her iki aşamadan elde edilen verilerin entegrasyonu,hem düzenlemenin yüksek doğrulukla gerçekleştiğini doğrulamış hem de popülasyondaki düzenleme oranının güvenilir bir şekilde belirlenmesini sağlamıştır. Sonuç: Sonuç olarak,bu tez çalışması,onkojenik BCR-ABL1 füzyon genini ilk kez PE teknolojisi ile hedefleyerek,KML için kalıcı bir tedavi potansiyeli sunan yeni ve özgün bir yaklaşım ortaya koymuştur.K562 hücre hattında %10.64 verimlilikle başarılı bir düzenleme sağlandığı gösterilmiş ve bu düşük frekanslı düzenlemelerin tespiti için standart yöntemlerin yetersizliğini aşan iki aşamalı özgün bir NGS analiz yöntemi geliştirilmiştir.Elde edilen bu oran,zor düzenlenebilir kabul edilen K562 hücre hattında,anlamlı bir başlangıç noktası olarak yorumlanmıştır.Bu umut verici sonuçlar,PE teknolojisinin yüksek özgünlüğü ve güvenliği ile birleştiğinde,düzenleme verimliliğinin artırılması ve in vivo modellere taşınması gibi gelecek çalışmalar için sağlam bir temel oluşturmakta ve bu yaklaşımın KML tedavisinde kalıcı bir çözüm sunma vaadini güçlendirmektedir.
Özet (Çeviri)
Objective: Prime Editing (PE) is one of the new approaches in gene editing, among CRISPR-Cas technologies, showing high efficiency and high specificity to the selected sequence. This study aimed to apply PE in the K562 cell line and to offer a new strategy in the field of gene therapy for the treatment of the disease through genetic editing by trying a different approach than current approaches in the BCR-ABL1 fusion oncogene of Chronic Myeloid Leukemia (CML). Materials and Methods: In this study, a novel method targeting BCR-ABL1 fusion, the fundamental mechanism of CML pathogenesis, was developed. Using the K562 cell line, a specific termination sequence was added to the BCR-ABL1 junction to terminate translation. First, the target region sequence was determined. The most specific part of the study, the epegRNA molecule, was designed. EpegRNA synthesis was performed using the Golden Gate Cloning method. The epegRNA was ligated to the vector. Transformation and transfection procedures were applied. The PE efficiency rate was analyzed using the Next Generation Sequencing (NGS) method using two different and complementary bioinformatics approaches. First, the total wild-type (WT) allele population was determined with the P2 primer set. In the next step, the specifically designed P3 primer set was used to enrich and amplify only the edited alleles. The raw data obtained from NGS were analyzed using Integrative Genomics Viewer (IGV) by both direct counting with custom scripts and alignment to custom-generated reference sequences. has been confirmed. Results: Editing efficiency was calculated as 10.64%. It has been shown that the standard NND analysis is insufficient to detect low-frequency edits due to negative Polymerase Chain Reaction (PCR) bias. To overcome this limitation, a selective PCR approach was applied that enriches only edited alleles. This allowed for the precise calculation of the edit rate. Integration of data from both stages confirmed that editing occurred with high accuracy and provided a reliable determination of the edit rate in the population. Conclusion: This thesis demonstrates a novel and unique approach that offers the potential for a durable treatment for CML by targeting the oncogenic BCR-ABL1 fusion gene for the first time using PE technology. Successful editing was demonstrated with an efficiency of 10.64% in the K562 cell line, and a unique two-stage NGS analysis method was developed to overcome the inadequacy of standard methods for the detection of these low-frequency editing. This rate was interpreted as a meaningful starting point in the K562 cell line, which is considered difficult to edit. These promising results, combined with the high specificity and safety of PE technology, provide a solid foundation for future studies to increase editing efficiency and translate it to in vivo models, reinforcing the promise of this approach as a durable solution for the treatment of CML.
Benzer Tezler
- K562 hücre hattında prime editing yöntemiyle t315ı mutasyonunun oluşturulmasına yönelik yeni moleküler yaklaşım
A novel molecular approach for the generation of the t315i mutation in the K562 cell line by prime editing
BATUHAN ŞANLITÜRK
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
GenetikSelçuk ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZKAN BAĞCI
- Mal de Meleda (MDM) hastalığında SLURP1 geninin prime editing teknolojisi kullanılarak düzenlenmesi
Editing of the SLURP1 gene in Mal de Meleda (MDM) disease using prime editing technology
FEYZA MERMER
- Functional capabilities of lentiviral motor neuron-specific promoter driven SMN1 gene expression and SMN2 gene editing strategy using crispr-prime editing
Motor nöron-spesifik promotör kontrollü lentiviral smn1 gen ekspresyonunun ve crıspr-prime editing kullanılarak smn2 gen düzenleme stratejisinin fonksiyonel kapasiteleri
SEVGİ OLTAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
GenetikÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CİHAN TAŞTAN
- In vitro investigation of Antisense Xeno Nucleic Acid (XNA-ASO) approaches to increase inclusion of Exon7 in SMN2 (survival motor neuron) gene in parallel with stable CRISPR-prime editing modification approaches
SMN2 (survival kalma motor nöronu) geninde Ekson7 dahil edilmesini artırmak için Antisense Kseno Nükleik Asit (XNA-ASO) yaklaşımlarının, stabil CRISPR-prime düzenleme modifikasyon yaklaşımlarıyla paralel olarak in vitro araştırılması
HALE AHSEN BABAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
GenetikÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
- Crıspr prıme edıtıng gen düzenleme yaklaşımları kullanılarak Survıval Motor Nöron-2 (SMN2) geni üzerindeki nokta mutasyonların onarım etkinliğinin araştırılması
Investigation of the repair efficiency of point mutations on the Survival Motor Neuron-2 (SMN2) gene using crispr prime editing gene editing approaches
ENES BAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Moleküler TıpÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN