Geri Dön

Klebsiella pneumoniae'nin farklı kapsüler tiplerine özgü faj türevli depolimeraz proteinin tanımlanması ve antimikrobiyal etkinliğinin değerlendirilmesi

Identification of phage-derived depolymerase protein specific to different capsular types of Klebsiella pneumoniae and evaluation of its antimicrobial efficacy

PDF İndir

  1. Tez No: 1021939
  2. Yazar: SEZİN ÜNLÜ ÇELEBİ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYLİN ÜSKÜDAR GÜÇLÜ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Biyoteknoloji, Microbiology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Antimikrobiyal aktivite, Bakteriyofajlar, Depolimeraz, Antimicrobial activity, Bacteriophages, Depolymerase
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Başkent Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Antibiyotik direnci, dünya genelinde önemli bir halk sağlığı sorunu olup çoklu ilaç direncine (ÇİD) sahip bakterilerin yayılması yeni tedavi stratejilerini gerekli kılmaktadır. Bu patojenler arasında yer alan Klebsiella pneumoniae, kapsüler polisakkaritleri (KPS) sayesinde konak bağışıklığından kaçabilmekte, antibiyotik penetrasyonunu zorlaştırmakta ve biyofilm oluşumuna katkı sağlamaktadır. Bu nedenle, bakteriyofajlar ve özellikle kapsülü hedef alabilen faj kaynaklı enzimler, umut verici alternatif yaklaşımlar olarak öne çıkmaktadır. Önceki çalışmamızda, klinik K. pneumoniae izolatına karşı izole edilen ve OQ790080 Genbank kodlu Kpn17 fajının ORF13 bölgesinin bir kuyruk lifi proteini olduğu görülmüştür. Bu çalışmanın amacı, K. pneumoniae izolatlarının kapsüler tiplerinin wzi-sekanslama tekniğiyle belirlenmesi ve faj Kpn17 kuyruk lifi proteininin farklı kapsüler tiplerdeki klinik K. pneumoniae izolatlarına ve farklı bakterilere karşı litik ve biyofilm üzerindeki etkisinin araştırılmasıdır. Koleksiyonumuzda bulunan, çeşitli klinik numunelerden izole edilen karbapenem dirençli 57 klinik K. pneumoniae izolatı çalışmaya dahil edilmiştir. İzolatların kapsül tipleri, wzi gen fragmanları, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile amplifiye edildikten sonra Sanger dizileme yöntemi ile belirlenmiştir. Faj Kpn17'nin kuyruk lifi bölgesi, özhül primerlerle amplifiye edilip pET22b(+) ekspresyon vektörüne klonlanmış ve E. coli BL21 (DE3)'e aktarılmıştır. Transformasyon, koloni PCR ve Sanger dizileme ile doğrulanmış ve pozitif klon seçilerek IPTG ile protein ekspresyonu indüklenmiştir. Elde edilen His-etkili rekombinant protein, nikel boncuklar ile saflaştırılmış ve SDS-PAGE ve Western blot ile doğrulanmıştır. Proteinin anti-kapsüler etkinliği Maneval boyama yöntemi ile, kapsül üzerindeki etkisi Geçirimli elektron mikroskopu (TEM) ile gösterilmiştir. İzole edilen rekombinant proteinin hem biyofilm oluşumuna hem de önceden oluşturulmuş olgun biyofilme olan etkinliği biyofilm assay yöntemi ile belirlenmiştir. Sanger dizileme sonucunda 57 klinik izolatın %31.6'sı (n=18) K14K64 kapsüler tipinde bulunurken %17.5'si (n=10) K17, %8.8'i (n=5) K39 ve KL102KL149KL155 kapsüler tipinde bulunmuştur. Koloni PCR yöntemi ile ilgili genin başarılı transformasyonu 715 bp'lik bantlar ile doğrulanmış ve Sanger dizileme ile teyit edilen pozitif klon protein ekspresyonu için seçilmiştir. İndüksiyon sonrasında hedef proteinin başarılı bir şekilde eksprese edildiği ve nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldığı gösterilmiş; elde edilen rekombinant proteinin varlığı doğrulanmıştır. Üretilen rekombinant protein, özellikle yüksek konsantrasyonlarda K. pneumoniae izolatlarında biyofilm oluşumunu anlamlı şekilde inhibe etmiş ve bazı suşlarda olgun biyofilmleri azaltmıştır. Klebsiella dışı bakterilerde etkinlik değişken olmakla birlikte, Staphylococcus aureus ATCC-6538 suşunda belirgin bir biyofilm inhibisyonu gözlenmiştir. Maneval boyama, enzimin Kpn17 suşunda kapsülü incelttiğini ve yapısal bütünlüğünü bozduğunu göstermiştir. S. aureus üzerinde gözlenen belirgin antibiyofilm aktivite, proteinin etki spektrumunun beklenenden daha geniş olabileceğini düşündürtmüştür. Elde edilen bulgular, faj türevi litik proteinlerin antibiyotiklere alternatif veya tamamlayıcı biyoterapötik ajanlar olarak kullanım potansiyelini ortaya koymaktadır.

Özet (Çeviri)

Antimicrobial resistance represents a major global public health concern, with the emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria necessitating new therapeutic strategies. Among these pathogens, Klebsiella pneumoniae can evade host immunity, hinder antibiotic penetration, and contribute to biofilm formation through its capsular polysaccharides (CPS). Consequently, bacteriophages, particularly phage-derived enzymes targeting the capsule, have emerged as promising alternative approaches. In our previous study, a phage Kpn17 (GenBank accession OQ790080) was isolated against clinical K. pneumoniae strain, revealing that its ORF13 region encodes a tail fiber protein. The aim of this study was to determine the capsular types of isolates using wzi sequencing and to investigate the lytic and antibiofilm activities of the Kpn17 tail fiber protein across different capsular types and species. A total of 57 carbapenem-resistant clinical K. pneumoniae isolates from various specimens were included. DNA extraction was performed, and capsular types were determined by PCR amplification of wzi gene fragments followed by Sanger sequencing. The Kpn17 tail fiber gene was amplified, cloned into the pET22b(+) expression vector, and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). Successful transformation was confirmed by colony PCR and Sanger sequencing, and a positive clone was selected for IPTG-induced protein expression. The His-tagged recombinant protein was purified using nickel affinity chromatography, and its presence was verified by SDS-PAGE and Western blot analyses. The anti-capsular activity of the recombinant protein was assessed via Maneval staining, and its effects on the capsule were visualized using transmission electron microscopy (TEM). The protein's impact on biofilm formation and preformed mature biofilms was evaluated using a biofilm assay. Sanger sequencing identified K14/K64 as the most prevalent capsular type among the isolates (31.6%, n = 18), followed by K17 (17.5%, n = 10), K39 (8.8%, n = 5), and KL102/KL149/KL155 (8.8%, n = 5). Colony PCR confirmed successful gene cloning with a 715 bp band, and sequencing verified the positive clone selected for protein expression. Following induction, the target protein was successfully expressed and purified, and its presence was confirmed. The recombinant protein significantly inhibited biofilm formation in K. pneumoniae isolates at higher concentrations and reduced mature biofilms in some strains. Activity against non-Klebsiella bacteria varied, although notable biofilm inhibition was observed in Staphylococcus aureus ATCC-6538. Maneval staining demonstrated that the enzyme disrupted the capsule and compromised its structural integrity in Kpn17 strains. The antibiofilm activity against S. aureus suggests that the protein have a broader spectrum of activity. These findings highlight the potential of phage-derived lytic proteins as alternative or adjunctive biotherapeutic agents to conventional antibiotics.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    745948

    Hastane kaynaklı klebsiella pneumoniae'ya yönelik inaktif ve rekombinant aşı denemeleri

    Inactive and recombinant vaccine trials for hospital acquired klebsiella pneumoniae

    AYŞEGÜL İLBAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiSelçuk Üniversitesi

    Veterinerlik Mikrobiyolojisi Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ASLI SAKMANOĞLU

  2. Tez No

    921627

    Farklı klı̇nı̇k kaynaklardan ı̇zole edı̇len Klebsıella pneumonıae'nın çekirdek algılayıcı genlerı̇nı̇n moleküler tespı̇tı̇

    Molecular detection of core sensing genes of Klebsiella pneumoniae isolated from different clinical sources

    MOHAMMED ALI MOHAMMED AL-BADRI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MELDA DÖLARSLAN

  3. Tez No

    987845

    Molecular detection of FIM H, MRKD, and WCAG genes responsible for biofilm formation in klebsiella pneumoniae isolated from different sites of infection

    Farklı enfeksiyon yerlerinden izole edilen klebsıella pneuomonae'da biyofilm oluşumundan sorumlu FİM H, MRKD, ve WCAG genlerinin moleküler saptanması

    NOOR ABDUL JABAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Moleküler TıpKırşehir Ahi Evran Üniversitesi

    Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERGİN KARİPTAŞ

  4. Tez No

    779240

    Molecular study and PCR-RFLP analysis of Klebsiella pneumoniae isolated from Iraqi patients

    Iraklı hastalardan izole edilen Klebsiella pneumoniae'nin moleküler çalışması ve PCR-RFLP analizi

    ZAINAB ALI CHALLOOB KINANI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SONGÜL ŞAHİN

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ILHAM ABDULHADİ KHALAF AL-RUBAYE

  5. Tez No

    421325

    Farklı Klebsiella türleri ile siyanür biyoyıkımının araştırılması

    Investigation of cyanide biodegradation by different Klebsiella strains

    NERMİN HANDE AVCIOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    MikrobiyolojiHacettepe Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. IŞIL SEYİS BİLKAY

Geri Dön