Klebsiella pneumoniae'nin farklı kapsüler tiplerine özgü faj türevli depolimeraz proteinin tanımlanması ve antimikrobiyal etkinliğinin değerlendirilmesi
Identification of phage-derived depolymerase protein specific to different capsular types of Klebsiella pneumoniae and evaluation of its antimicrobial efficacy
- Tez No: 1021939
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AYLİN ÜSKÜDAR GÜÇLÜ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Biyoteknoloji, Microbiology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Antimikrobiyal aktivite, Bakteriyofajlar, Depolimeraz, Antimicrobial activity, Bacteriophages, Depolymerase
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Başkent Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Antibiyotik direnci, dünya genelinde önemli bir halk sağlığı sorunu olup çoklu ilaç direncine (ÇİD) sahip bakterilerin yayılması yeni tedavi stratejilerini gerekli kılmaktadır. Bu patojenler arasında yer alan Klebsiella pneumoniae, kapsüler polisakkaritleri (KPS) sayesinde konak bağışıklığından kaçabilmekte, antibiyotik penetrasyonunu zorlaştırmakta ve biyofilm oluşumuna katkı sağlamaktadır. Bu nedenle, bakteriyofajlar ve özellikle kapsülü hedef alabilen faj kaynaklı enzimler, umut verici alternatif yaklaşımlar olarak öne çıkmaktadır. Önceki çalışmamızda, klinik K. pneumoniae izolatına karşı izole edilen ve OQ790080 Genbank kodlu Kpn17 fajının ORF13 bölgesinin bir kuyruk lifi proteini olduğu görülmüştür. Bu çalışmanın amacı, K. pneumoniae izolatlarının kapsüler tiplerinin wzi-sekanslama tekniğiyle belirlenmesi ve faj Kpn17 kuyruk lifi proteininin farklı kapsüler tiplerdeki klinik K. pneumoniae izolatlarına ve farklı bakterilere karşı litik ve biyofilm üzerindeki etkisinin araştırılmasıdır. Koleksiyonumuzda bulunan, çeşitli klinik numunelerden izole edilen karbapenem dirençli 57 klinik K. pneumoniae izolatı çalışmaya dahil edilmiştir. İzolatların kapsül tipleri, wzi gen fragmanları, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile amplifiye edildikten sonra Sanger dizileme yöntemi ile belirlenmiştir. Faj Kpn17'nin kuyruk lifi bölgesi, özhül primerlerle amplifiye edilip pET22b(+) ekspresyon vektörüne klonlanmış ve E. coli BL21 (DE3)'e aktarılmıştır. Transformasyon, koloni PCR ve Sanger dizileme ile doğrulanmış ve pozitif klon seçilerek IPTG ile protein ekspresyonu indüklenmiştir. Elde edilen His-etkili rekombinant protein, nikel boncuklar ile saflaştırılmış ve SDS-PAGE ve Western blot ile doğrulanmıştır. Proteinin anti-kapsüler etkinliği Maneval boyama yöntemi ile, kapsül üzerindeki etkisi Geçirimli elektron mikroskopu (TEM) ile gösterilmiştir. İzole edilen rekombinant proteinin hem biyofilm oluşumuna hem de önceden oluşturulmuş olgun biyofilme olan etkinliği biyofilm assay yöntemi ile belirlenmiştir. Sanger dizileme sonucunda 57 klinik izolatın %31.6'sı (n=18) K14K64 kapsüler tipinde bulunurken %17.5'si (n=10) K17, %8.8'i (n=5) K39 ve KL102KL149KL155 kapsüler tipinde bulunmuştur. Koloni PCR yöntemi ile ilgili genin başarılı transformasyonu 715 bp'lik bantlar ile doğrulanmış ve Sanger dizileme ile teyit edilen pozitif klon protein ekspresyonu için seçilmiştir. İndüksiyon sonrasında hedef proteinin başarılı bir şekilde eksprese edildiği ve nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldığı gösterilmiş; elde edilen rekombinant proteinin varlığı doğrulanmıştır. Üretilen rekombinant protein, özellikle yüksek konsantrasyonlarda K. pneumoniae izolatlarında biyofilm oluşumunu anlamlı şekilde inhibe etmiş ve bazı suşlarda olgun biyofilmleri azaltmıştır. Klebsiella dışı bakterilerde etkinlik değişken olmakla birlikte, Staphylococcus aureus ATCC-6538 suşunda belirgin bir biyofilm inhibisyonu gözlenmiştir. Maneval boyama, enzimin Kpn17 suşunda kapsülü incelttiğini ve yapısal bütünlüğünü bozduğunu göstermiştir. S. aureus üzerinde gözlenen belirgin antibiyofilm aktivite, proteinin etki spektrumunun beklenenden daha geniş olabileceğini düşündürtmüştür. Elde edilen bulgular, faj türevi litik proteinlerin antibiyotiklere alternatif veya tamamlayıcı biyoterapötik ajanlar olarak kullanım potansiyelini ortaya koymaktadır.
Özet (Çeviri)
Antimicrobial resistance represents a major global public health concern, with the emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria necessitating new therapeutic strategies. Among these pathogens, Klebsiella pneumoniae can evade host immunity, hinder antibiotic penetration, and contribute to biofilm formation through its capsular polysaccharides (CPS). Consequently, bacteriophages, particularly phage-derived enzymes targeting the capsule, have emerged as promising alternative approaches. In our previous study, a phage Kpn17 (GenBank accession OQ790080) was isolated against clinical K. pneumoniae strain, revealing that its ORF13 region encodes a tail fiber protein. The aim of this study was to determine the capsular types of isolates using wzi sequencing and to investigate the lytic and antibiofilm activities of the Kpn17 tail fiber protein across different capsular types and species. A total of 57 carbapenem-resistant clinical K. pneumoniae isolates from various specimens were included. DNA extraction was performed, and capsular types were determined by PCR amplification of wzi gene fragments followed by Sanger sequencing. The Kpn17 tail fiber gene was amplified, cloned into the pET22b(+) expression vector, and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). Successful transformation was confirmed by colony PCR and Sanger sequencing, and a positive clone was selected for IPTG-induced protein expression. The His-tagged recombinant protein was purified using nickel affinity chromatography, and its presence was verified by SDS-PAGE and Western blot analyses. The anti-capsular activity of the recombinant protein was assessed via Maneval staining, and its effects on the capsule were visualized using transmission electron microscopy (TEM). The protein's impact on biofilm formation and preformed mature biofilms was evaluated using a biofilm assay. Sanger sequencing identified K14/K64 as the most prevalent capsular type among the isolates (31.6%, n = 18), followed by K17 (17.5%, n = 10), K39 (8.8%, n = 5), and KL102/KL149/KL155 (8.8%, n = 5). Colony PCR confirmed successful gene cloning with a 715 bp band, and sequencing verified the positive clone selected for protein expression. Following induction, the target protein was successfully expressed and purified, and its presence was confirmed. The recombinant protein significantly inhibited biofilm formation in K. pneumoniae isolates at higher concentrations and reduced mature biofilms in some strains. Activity against non-Klebsiella bacteria varied, although notable biofilm inhibition was observed in Staphylococcus aureus ATCC-6538. Maneval staining demonstrated that the enzyme disrupted the capsule and compromised its structural integrity in Kpn17 strains. The antibiofilm activity against S. aureus suggests that the protein have a broader spectrum of activity. These findings highlight the potential of phage-derived lytic proteins as alternative or adjunctive biotherapeutic agents to conventional antibiotics.
Benzer Tezler
- Boğazdan izole edilen coliform bakterilerin B- laktamaz enzim aktivitelerinin tesbit edilmesi ve B-laktamaz pozitif coliformların penisilinetkisinin inaktivasyonunun in vitro deneylerle gösterilmesi
The Detection of beta-lactamasa activity of coliform bacteria isolated from th roat cultures and slovving the inactivation of penicilin by this beta lactamase produced by this caliform organisms
GÜVEN URAZ
- Yöremizde son bir yılda üriner infeksiyona neden olan ureopat hogenic e. coli (UPEC) lerin yeni kuşak sefalosporinler ve ofloxacine karşı davranışları
Başlık çevirisi yok
RESUL BALKAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1988
Atatürk ÜniversitesiKlinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Yükleniyor...
- Çocuklarda ve erişkinlerde hastalık yapan aeromonas hydrophila ve enterobacterin AH besiyerinde izolasyonu
Isolation in AH media of aeromonas hydrophila and enterobacter which cause diseases in children and adults
LALE ÇANKAYA