Geri Dön

Cloning of an extracellular thermostable acid protease from Thermoplasma volcanium in E.coli

Thermoplasma volcanium'un hücre dışı termostabil bir asit protezanının E.coli'de klonlanması

  1. Tez No: 143356
  2. Yazar: HATİCE ÖZEL
  3. Danışmanlar: PROF. DR. SEMA KOCABIYIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Termopsin, Termostabil enzim, Thermoplasma volcanium, klonlama, Thermopsin, Thermostable enzyme, Thermoplasma volcanium, cloning
  7. Yıl: 2003
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 134

Özet

Genel olarak asit proteaz olarak bilinen aspartik proteazlar, katalitik aktivite için aktif bölgelerindeki iki aspartil grubuna bağımlı olan endopeptidazlardır. pH 2.0-6.0 da aktif olan ve pepstatin inhibasyonuna duyarlı olan aspartik proteazlar Ökaryotlardan, Virüslerden ve Arkealardan izole edilmiştir. Bu grup proteazlar, birçok endüstriyel uygulamalarının yanısıra fizyolojik ve patolojik proseslerde de önemli role sahiptirler. Yüksek süt çöktürme, düşük proteolitik aktivitelerinden dolayı aspartik proteazlar çoğunlukla peynir yapımında tercih edilirler. Bu çalışmada, bir termoasidofilik arkeon olan, Thermoplasma (Tp.) volcanium'un hücre dışı asit proteaz enzim üretimi ve katalitik aktivitesi için optimum parametreler belirlenmiştir. Tp. volcanium'un gelişme ve asit proteaz üretimi için (1.08 U) optimum pH değeri, 55 °C de inkübasyon periyodundan sonra, 2.7 olarak bulunmuştur. Bu asit proteazın kazeinolitik aktivitesi için optimum pH değeri 4.2 ve optimum sıcaklık 55°C'dir. Çeşitli türlerin aspartik proteazlanmn yüksek oranda korunmuş olan amino asit dizileri göz önünde bulundurularak, Tp. volcanium 'dan olası asit proteazın belli bir gen dizisini çoğaltmak üzere dejenere PCR primerleri tasarlanmıştır. 933 bp bu uzunluğundaki PCR ürünü pDrive vektörü kullanılarak E. coli TG1 susunda klonlanmıştır. Ancak dizi veritabanı taranması klonlanmış ve kısmen DNA dizisi belirlenmiş bu gen parçasının Tp. volcaniurrC un hipotetik bir protein (muhtemelen bir amino acid permease) geni ile ilgili olabileceğini göstermiştir. Olası asit proeaz geninin çoğaltılması için alternatif strateji olarak, Tp. volcanium genomunun tahmini termopsin gen dizisi dikkate alınarak ileri ve geri primerler tasarlanmıştır. PCR ile çoğaltılan 3080 bp lik bu asit proteaz geni pDrive vektörü kullanılarak E. coli TG1 susunda klonlanmıştır. Rekombinant plasmid restriksiyon analizi ve Southern Blot/Hibridizasyon tekniği ile yapısal olarak karekterize edilmiştir. Çeşitli arkealann asit termopsin amino asit dizileri eşleştirilmiş ve en yüksek homoloji (44%) Tp. volcanium ve karakterize edilmemiş olan Tp. acidophilum termopsini, arasinda bulunmuştur.

Özet (Çeviri)

Aspartic proteases, commonly known as acid proteases, are endopeptidases that are dependent on two aspartyl residues at the active site for their catalytic activity. Aspartic proteases, which are active at pH 2.0-6.0 and sensitive to inhibition by pepstatin, are purified from Eukaryotes, Viruses and Archaea. Proteases of this class, have significant roles in physiological and pathological processes, besides their several industrial applications. Due to their high milk clotting activity with low proteolytic activity, aspartic proteases are mostly preferred for the manufacturing of cheese. In this study, we have identified optimum parameters for the production and catalytic activity of an extracellular acid protease from a thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma (Tp.) volcanium. The optimal pH value for the growth and acid protease production (1.08 U) of Tp. volcanium was found to be 2.7, over an incubation period of 55°C. Optimum pH was 4.2, and optimum temperature was 55°C for the caseionolytic activity of this acid protease. Referring to highly conserved region of aspartic proteases from various species, degenerate primers were designed to amplify an internal gene fragment of putative acid protease gene from Thermoplasma volcanium. PCR amplified 933 bp fragment was cloned into pDrive Cloning Vector in E.coli TGI strain. However, the sequence data search demonstrated that cloned and partially sequenced gene fragment could be related to an hypothetical protein (possibly an amino acid permease gene of Tp. volcanium. As an alternative strategy, to amplify the putative acid protease gene forward and reverse primers were designed considering to the predicted thermopsin gene sequence of Tp. volcanium genome. PCR amplified 3080 bp acid protease was cloned into pDrive Cloning Vector in E. coli. The recombinant plasmid was structurally characterized by restriction analysis and Southern Blotting and Hybridization. The amino acid sequences of thermopsins from various Archaea were aligned and the highest homology (% 44) was found between the Thermoplasma volcanium and uncharacterized Tp. acidophilum thermopsin.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    65117

    Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli

    Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması

    BERNA SARIYAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1997

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF. DR. AMABLE HORTAÇSU

  2. Tez No

    177578

    Cloning of the Scytalidium thermophilum bifunctional catalase/phenol oxidase gene and expression in Aspergillus sojae

    Scytalidium thermophilum çift aktiviteli katalaz/fenoloksidaz geninin klonlanması ve Aspergillus sojae'de heterolog ifadesi

    HATİCE ÖZLEM ERÇİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2008

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. UFUK BAKIR

    PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL

  3. Tez No

    713928

    Expression, purification, and characterization of recombinant human IL-2

    Rekombinant insan IL-2'nin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    BUSE AKGÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  4. Tez No

    593202

    Termofilik bir aktinomiset olan Thermobifida fusca EFTS 7A suşundan selülaz geninin klonlanmasi ve rekombinant proteininin üretilmesi

    Cloning of cellulase genes from Thermobifida fusca EFTS 7A which is a thermophylic actinomyces and production of its recombinant protein

    GİZEM VAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyolojiEge Üniversitesi

    Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSMAİL KARABOZ

  5. Tez No

    213891

    Anoxybacillus gonensis G2T ksiloz izomeraz geninin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Cloning of anoxybacillus gonensis G2T xylose isomerase gene and purification and characterization of gene product

    DERYA YANMIŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    BiyokimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ

Geri Dön