Cloning of an extracellular thermostable acid protease from Thermoplasma volcanium in E.coli
Thermoplasma volcanium'un hücre dışı termostabil bir asit protezanının E.coli'de klonlanması
- Tez No: 143356
- Danışmanlar: PROF. DR. SEMA KOCABIYIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Termopsin, Termostabil enzim, Thermoplasma volcanium, klonlama, Thermopsin, Thermostable enzyme, Thermoplasma volcanium, cloning
- Yıl: 2003
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 134
Özet
Genel olarak asit proteaz olarak bilinen aspartik proteazlar, katalitik aktivite için aktif bölgelerindeki iki aspartil grubuna bağımlı olan endopeptidazlardır. pH 2.0-6.0 da aktif olan ve pepstatin inhibasyonuna duyarlı olan aspartik proteazlar Ökaryotlardan, Virüslerden ve Arkealardan izole edilmiştir. Bu grup proteazlar, birçok endüstriyel uygulamalarının yanısıra fizyolojik ve patolojik proseslerde de önemli role sahiptirler. Yüksek süt çöktürme, düşük proteolitik aktivitelerinden dolayı aspartik proteazlar çoğunlukla peynir yapımında tercih edilirler. Bu çalışmada, bir termoasidofilik arkeon olan, Thermoplasma (Tp.) volcanium'un hücre dışı asit proteaz enzim üretimi ve katalitik aktivitesi için optimum parametreler belirlenmiştir. Tp. volcanium'un gelişme ve asit proteaz üretimi için (1.08 U) optimum pH değeri, 55 °C de inkübasyon periyodundan sonra, 2.7 olarak bulunmuştur. Bu asit proteazın kazeinolitik aktivitesi için optimum pH değeri 4.2 ve optimum sıcaklık 55°C'dir. Çeşitli türlerin aspartik proteazlanmn yüksek oranda korunmuş olan amino asit dizileri göz önünde bulundurularak, Tp. volcanium 'dan olası asit proteazın belli bir gen dizisini çoğaltmak üzere dejenere PCR primerleri tasarlanmıştır. 933 bp bu uzunluğundaki PCR ürünü pDrive vektörü kullanılarak E. coli TG1 susunda klonlanmıştır. Ancak dizi veritabanı taranması klonlanmış ve kısmen DNA dizisi belirlenmiş bu gen parçasının Tp. volcaniurrC un hipotetik bir protein (muhtemelen bir amino acid permease) geni ile ilgili olabileceğini göstermiştir. Olası asit proeaz geninin çoğaltılması için alternatif strateji olarak, Tp. volcanium genomunun tahmini termopsin gen dizisi dikkate alınarak ileri ve geri primerler tasarlanmıştır. PCR ile çoğaltılan 3080 bp lik bu asit proteaz geni pDrive vektörü kullanılarak E. coli TG1 susunda klonlanmıştır. Rekombinant plasmid restriksiyon analizi ve Southern Blot/Hibridizasyon tekniği ile yapısal olarak karekterize edilmiştir. Çeşitli arkealann asit termopsin amino asit dizileri eşleştirilmiş ve en yüksek homoloji (44%) Tp. volcanium ve karakterize edilmemiş olan Tp. acidophilum termopsini, arasinda bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
Aspartic proteases, commonly known as acid proteases, are endopeptidases that are dependent on two aspartyl residues at the active site for their catalytic activity. Aspartic proteases, which are active at pH 2.0-6.0 and sensitive to inhibition by pepstatin, are purified from Eukaryotes, Viruses and Archaea. Proteases of this class, have significant roles in physiological and pathological processes, besides their several industrial applications. Due to their high milk clotting activity with low proteolytic activity, aspartic proteases are mostly preferred for the manufacturing of cheese. In this study, we have identified optimum parameters for the production and catalytic activity of an extracellular acid protease from a thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma (Tp.) volcanium. The optimal pH value for the growth and acid protease production (1.08 U) of Tp. volcanium was found to be 2.7, over an incubation period of 55°C. Optimum pH was 4.2, and optimum temperature was 55°C for the caseionolytic activity of this acid protease. Referring to highly conserved region of aspartic proteases from various species, degenerate primers were designed to amplify an internal gene fragment of putative acid protease gene from Thermoplasma volcanium. PCR amplified 933 bp fragment was cloned into pDrive Cloning Vector in E.coli TGI strain. However, the sequence data search demonstrated that cloned and partially sequenced gene fragment could be related to an hypothetical protein (possibly an amino acid permease gene of Tp. volcanium. As an alternative strategy, to amplify the putative acid protease gene forward and reverse primers were designed considering to the predicted thermopsin gene sequence of Tp. volcanium genome. PCR amplified 3080 bp acid protease was cloned into pDrive Cloning Vector in E. coli. The recombinant plasmid was structurally characterized by restriction analysis and Southern Blotting and Hybridization. The amino acid sequences of thermopsins from various Archaea were aligned and the highest homology (% 44) was found between the Thermoplasma volcanium and uncharacterized Tp. acidophilum thermopsin.
Benzer Tezler
- Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli
Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması
BERNA SARIYAR
- Cloning of the Scytalidium thermophilum bifunctional catalase/phenol oxidase gene and expression in Aspergillus sojae
Scytalidium thermophilum çift aktiviteli katalaz/fenoloksidaz geninin klonlanması ve Aspergillus sojae'de heterolog ifadesi
HATİCE ÖZLEM ERÇİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2008
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UFUK BAKIR
PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL
- Expression, purification, and characterization of recombinant human IL-2
Rekombinant insan IL-2'nin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
BUSE AKGÜN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Termofilik bir aktinomiset olan Thermobifida fusca EFTS 7A suşundan selülaz geninin klonlanmasi ve rekombinant proteininin üretilmesi
Cloning of cellulase genes from Thermobifida fusca EFTS 7A which is a thermophylic actinomyces and production of its recombinant protein
GİZEM VAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyolojiEge ÜniversitesiTemel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSMAİL KARABOZ
- Anoxybacillus gonensis G2T ksiloz izomeraz geninin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve karakterizasyonu
Cloning of anoxybacillus gonensis G2T xylose isomerase gene and purification and characterization of gene product
DERYA YANMIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ