Geri Dön

Expression, purification, and characterization of recombinant human IL-2

Rekombinant insan IL-2'nin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 713928
  2. Yazar: BUSE AKGÜN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 85

Özet

Bağışıklık sistemi, sitokin adı verilen bir dizi küçük protein tarafından kontrol edilir. Sitokinler, oluşum, farklılaşma ve aktivasyon işlevleri aracılığıyla, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerinin korunmasını yönetir. Esas olarak mononükleer fagositler, dendritik hücreler ve antijen sunan hücreler tarafından oluşturulurlar ve hücreler arasında mediatör olarak görev yaparlar. Sitokin aracılığı ile hücreler arasında gerçekleştirelen etkileşimler otokrin (salgılandığı hücreye), parakrin (yakındaki hedef hücreye) ya da endoktrin (dolaşım aracılığıyla kana salınma ve uzak bir hücreye) etki şeklinde olabilir. İnterlökin (IL), immünomodülatör protein görevi gören bir tür sitokindir ve immün sistemden salgılanan sitokinlerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Çeşitli hücre ve doku tepkilerini indüklemekte görevlidir. İnterlökinler, lökositlerin (beyaz kan hücreleri) etkileşiminine aracılık ederler ve hücrelerin yüzeyindeki yüksek afiniteli reseptörlere bağlanarak immün yanıt oluştururlar. Enflamatuar ve immünolojik tepkiler sırasında meydana gelen hücresel oluşum, farklılaşma ve aktivasyonun düzenlenmesinde kritik bir rol oynarlar. İnterlökinler, dizi homolojisi, reseptör zinciri benzerliği ve fonksiyonel nitelikleri göz önünde bulundurularak isimlendirilmektedirler. İnterlökin-2 (IL-2), T lenfositlerinin büyümesi ve farklılaşmasından sorumlu keşfedilen ilk sitokindir. T hücreleri, B hücreleri, doğal öldürücü (NK) hücreler, lenfokinle aktive olan öldürücü hücreler ve makrofajların tümü, çoğalmalarını ve farklılaşmalarını düzenlemek için IL-2'ye ihtiyaç duymaktadırlar. İnterkökin-2 molekülü Mier et al. tarafından keşfedilerek, lökositler tarafından üretildiği ve lökositler üzerine etki ettiği için moleküle“IL-2”adı vermiştir. İnterlökin-2'nin keşfi, immünolojide bir dönüm noktası olarak kabul edilmektedir. Ancak IL-2'nin moleküler ve fonksiyonel karakterizasyonu söz konusu olduğunda tüm lenfokinler için ortak olan, az miktarda üretilmesi sorun yaratmaktadır. Bu sebeple, 1983 senesinde IL-2 cDNA klonu geliştirmek için Jurkat T hücresi lösemi hücre hattı kullanılmıştır. IL-2, 15.5 kDa moleküler ağırlığa sahip α-helix yapıda bir glikoproteindir. IL-2' nin tek bir polipeptit zincirinde 153 amino asit bulunur. İnsanda 4q26-28 kromozomunda bulunan IL-2 geni, dört ekzon ve üç introndan oluşmaktadır. IL-2, IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122) ve IL-2R (CD132) olarak bilinen üç farklı alt birimden oluşan bir reseptör kompleksine bağlanır. Bu reseptörün alt birimlerinin farklı kombinasyonları, değişen derecelerde afinite ile IL-2'ye bağlanır. Örneğin, αβγ heterotrimer, βγ dimer ve α zincir monomeri, sırasıyla“yüksek”,“orta”ve“düşük”afinite ile IL-2'ye bağlanır. xxiv IL-2'nin IL-2R heterodimer kompleksine bağlanması üç farklı yolağı aktive eder. IL-2 reseptörü ile etkileşime girdiğinde, kinazlar reseptör alt birimlerinin sitoplazmik bölgelerine bağlanır ve birçok proteinin tirozin fosforilasyonuna ve JAK/STAT, PI3K/AKT, ve Ras/MAPK gibi önemli yolakların aktive olmasına neden olur. Bu aktivasyon sonucunda IL-2, hücrenin hayatta kalmasını, çoğalmasını, hücre döngüsü ilerlemesini ve hedef gen transkripsiyonunu sağlar. IL-2 kanser tedavisinde başarıyla kullanılan ilk sitokindir. ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA), sırasıyla 1992 ve 1998'de melanom ve renal karsinoma tedavisi için yüksek doz IL2 kullanılmasına izin vermiştir. Düşük ve yüksek doz IL-2 tedavisi günümüzde hala denenmektedir. Örneğin, kanser hastalarında kemoterapi veya farklı sitokinlerle bir arada kullanılan IL-2 tedavisi, tek başına kullanılan IL-2'den daha yüksek etkinlik göstermiştir. Rekombinant IL-2'nin aynı zamanda tüm dünyayı etkisi altına alan, şiddetli akut solunum yolu hastalığına neden olan ve 2020 mart ayında Dünya Sağlık Örgütü tarafından pandemi olarak ilan edilen 2019 koronavirüs (COVID-19) için tedavi yöntemi olarak kullanılması gündeme gelmiştir. İmmün sistemde ektin rol oynayan T ve NK hücrelerini aktive etme özelliği nedeniyle rhIL-2, hastalığın tedavisinde tercih edilebilmektedir. Bu sayede, vücuttaki lenfosit sayısında artış gözlemlenlenir ve hastaların iyileşmesini hızlandırma potansiyelinden dolayı rIL2 kullanımı hastalar için faydalı olabilir. IL-2 tedavisinde karşılaşılan en büyük zorluk, immün sistemi aktive eden Teff ile immün sistemi baskılayan Treg arasındaki dengenin sağlanmasıdır. IL-2'nin E. coli'den türetilen, tecelelökin ve aldeslökin olmak üzere iki rekombinant formu mevcuttur. Ancak, yalnızca aldesleukin FDA onayına sahiptir. Rekombinant IL-2, doğal versiyonundan yapısal olarak farklılık göstermektedir ve glikolize değildir. Ayrıca, rekombinant IL-2 iki adet sisteine sahiptir. Yanlış sisteinler arasında kurulan disülfid bağının sebep olduğu yanlış katlanmanın önüne geçilmek için 125. pozisyondaki sistein amino asidi serin amino asidi ile değiştirilmiştir. Yine bu değiştirilmiş formdaki rekombinant IL-2, N-terminal alanine sahip değildir. Bu değişikliklere rağmen endojen ve rekombinant insan IL-2'sinin farmakolojik etkilerinin arasında herhangi bir fark görülmemektedir. Bu çalışmada, farklı E. coli suşlarından Rosetta (DE3) ve BL21 (DE3)'te protein üretimi denenerek, nadir E. coli kodonlarına sahip olan, ökaryotik proteinlerin ekspresyonunu artırmak için geliştirilmiş bir varyant olduğundan, Rosetta (DE3) konak hücresinin kullanılması tercih edilmiştir. Ekpresyon vektörü olarak protein üretiminde yaygın olarak kullanılan pET vektörlerinden pET30 (a) kullanılmıştır. Protein ekspresyonu IPTG ile indüklenen lac operonunun kontrolü altındadır. Bunu takiben, üretim koşullarını optimize etmek için uygun IPTG konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve süresi gibi parametreler denenerek, en yüksek verime sahip ortam şartları belirlenmiştir. Hücrede aşırı protein ekspresyonu sonucu inklüzyon cisimcikleri oluşur. Yapılan indüksiyon kontrolü ile rekombinant IL-2'nin hücre peletinde kaldığı ve çözünmüş halde bulunmadığı gözlemlenmiştir. İnklüzyon cisimcikleri sonikasyon ve ara yıkama işlemlerinden sonra 2 M üre içeren alkali tampon çözeltisi ile çözünür hale getirilmiştir. Sonrasında, denatüre halde bulunan protein diyaliz yöntemi kullanılarak üreden uzaklaştırılarak ve katlanmıştır. Hedef proteini konak hücre proteinlerinden ayırmak için anyon değişim kromatografisi kullanılmıştır. Saflatırma sonrasında total verim 1 litre bakteri kültüründe 0.114 mg olarak hesaplanmıştır. Saflaştırmanın etkinliğini doğrulamak için SDS-PAGE ve immünoblotlama yöntemlerinden yararlanılmıştır. Moleküler ağırlık, LC/MS aracılığıyla intak kütle analizi metodu kullanılarak belirlenmiştir. Bu analize göre, rhIL-2'nin monomer yapıda olup 15328 Da moleküler ağırlığa sahip olduğu doğrulanmıştır. Saflık tayini analizi kapiler elektroforez ile yapılmış ve proteinin yaklaşık olarak % 80 saflığa sahip olduğunu belirlenmiştir. Ayrıca proteinin pI değeri kapiler izoelektrik odaklama yöntemi kullanılarak 7.31 olarak belirlenmiştir. Proteinin amino asit sekansını doğrulamak için LC/MS ile yapılan peptit haritalama yönteminden yararlanılmıştır. Rekombinant interlökin-2'nin ikincil yapısı, dairesel dikroizm spektroskopisi kullanılarak araştırılmış olup, sonucunda yüksek konsantrasyonda α-heliks yapıda olduğu ortaya koyulmuştur. Proteinin aktif olduğunu göstermek için, THP-1 monosit hücreleri üzerindeki biyolojik etkisine bakılmıştır. MAPK sinyal yolağında bulununan proteinlerinden biri olan 1/2 (ERK) fosforile eden aktif bir protein olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, rekombinant interlökin 2'nin üst akım ve alt akım prosesleri geliştirildikten sonra karakterizasyonu yapılmıştır ve biyolojik etkinliğe sahip olduğu gözlemlenmiştir.

Özet (Çeviri)

Cytokines, which are small proteins secreted by the immune system, are in charge of directing the immune system. Through their formation, differentiation, and activation functions, cytokines govern the maintenance of innate and adaptive immune responses. They are primarily formed by mononuclear phagocytes, dendritic cells, and antigen-presenting cells. Interleukin (IL) is a kind of cytokine that acts as an immunomodulatory protein. It induces a variety of cell and tissue responses. Interleukins mediate the interaction of leukocytes (white blood cells) and initiate a response by attaching to high-affinity receptors on the surface of the cells. They play a critical role in the regulation of cellular formation, differentiation, and activation that occurs over the course of inflammatory and immunological responses. Each family is assigned an IL based on sequence homology, receptor chain similarity, and functional qualities. Interleukin-2 (IL-2) was the first cytokine discovered to stimulate the growth of T lymphocytes. T cells, B cells, natural killer (NK) cells, lymphokine-activated killer cells, and macrophages all require IL-2 to regulate their proliferation and differentiation. Mier et al. discovered the molecule and named it“IL-2”since it was produced by and acted on leukocytes. Its discovery is regarded as a milestone in immunology. However, there is one issue that is common to all lymphokines when it comes to the molecular and functional characterization of IL-2, and it is due to their production in small quantities. The cloning of cDNA for IL-2 was a significant turning point in 1983, precipitated by the discovery of IL-2. The Jurkat T cell leukemia cell line was employed for the IL-2 cDNA clone development. IL-2 is a 15.5 kDa glycoprotein that belongs to the cytokine family four α-helical bundles. There are 153 amino acid residues in a single polypeptide chain of IL-2. IL-2 binds to and communicates with a receptor complex composed of three different subunits known as IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122), and IL-2R (CD132). Different combinations of these three components bind to IL-2 with varying degrees of affinity. The αβγ heterotrimer, βγ dimer, and α chain monomer all bind to IL-2 with“high,”“intermediate,”and“low”affinity, respectively. Binding of IL-2 to the IL-2R heterodimer complex activates several pathways. In response to an interaction between interleukin-2 and its receptor, kinases connect to cytoplasmic areas of the receptor subunits, resulting in the tyrosine phosphorylation of many proteins and the activation of a number of signaling pathways, including JAK/STAT, PI-3K/AKT, and Ras/MAPK. IL-2 activity promotes cell survival, proliferation, cell cycle progression, and targeted gene transcription. Due to its ability to activate both T and NK cells, IL-2 was the first cytokine to be successfully used in cancer treatment. The US Food and Drug Administration authorized high-dose IL2 for the treatment of melanoma and renal cell carcinoma in xxii 1992 and 1998, respectively. Moreover, the use of recombinant IL-2 therapy may help researchers understand better the coronavirus disease 2019 (COVID-19), which is caused by a virus that leads to severe acute respiratory illnesses and has rapidly spread throughout the world. As a prospective treatment for this condition, the use of rIL2 may be beneficial for patients since it has the potential to accelerate disease recovery by increasing the number of lymphocytes in the body. A major difficulty is figuring out how to direct IL-2 activity toward Teffs and away from Tregs, which inhibit the immune system. IL-2 is available in two recombinant forms derived from E. coli, but only aldesleukin is FDA-approved. Recombinant IL-2 differs structurally from its natural version. IL-2 recombinant is not glycosylated and lacks N-terminal alanine. To avoid the formation of an incorrect disulfide bond, serine has been substituted with cysteine at amino acid position 125. The pharmacological actions of endogenous and recombinant human IL-2 are similar. In this study, E. coli Rosetta (DE3) was used as the host cell. Induction of protein expression was accomplished by the use of IPTG. Following that, inclusion bodies, which develop in the cell as a result of excessive protein expression, were separated and solubilized from cell lysates and refolded by step-wise dialysis. Anion exchange chromatography was used to separate the target protein from the rest of the protein mixture. After purification, the yield was determined to be 0.114 mg per liter of cell culture. SDS-PAGE and immunoblotting methods were used to validate the effectiveness of the purification. The molecular weight is estimated using intact mass analysis through LC/MS. The CE-SDS analysis revealed that rIL-2 has a purity of around 80%. In addition, the pI value of the protein was determined as 7.31 using the capillary isoelectric focusing method. The peptide mapping on LC-MS/MS is used to figure out the main structure of the protein that has been purified. The secondary structure of pure human interleukin-2 (hIL-2) was investigated using circular dichroism (CD), and the results revealed that it included a high concentration of alpha helices. The biological action of our IL-2 is determined by phosphorylation of one of the MAPK pathway proteins, extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK), on human monocytic cells, THP-1. An active protein has been produced as a result of this work. The experimental results indicate that the procedures established for generating and purifying the rIL-2 protein may be employed to create a pure product that maintains its bioactivity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    603527

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    BEGÜM ÖZDEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  2. Tez No

    505859

    Kan kanseri tedavisinde sıklıkla kullanılan insan hematopoetik büyüme faktörlerinden G-CSF ve GM-CSF'ün rekombinant olarak üretilmesi saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Production, purification and characterization of recombinant human hematopoietic growth factors such as G-CSF and GM-CSF which are frequently used in leukemia treatment

    YASEMİN BOZKURT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyomühendislikGaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SEÇİL ERDEN TAYHAN

  3. Tez No

    291056

    Rekombinant DPP IV enziminin Sf9 hücreleri kullanılarak biyoreaktörde üretimi ve karakterizasyonu

    Production and characterization of recombinant DPP IV enzyme in bioreactor by using Sf9 cells

    ÖZLEM ÜSTÜN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    BiyoteknolojiEge Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GAYE ÖNGEN

  4. Tez No

    597097

    Production of recombinant human serum albumin in transgenic plants and plant cells

    Başlık çevirisi yok

    AYŞE MELTEM MAVİTUNA

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2005

    BiyolojiRheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen

    PROF. DR. RAINER FISHER

  5. Tez No

    376235

    İnsan Paraoksonaz 1 (pon1) geninin klonlanması, Pichia pastoris'te ekspresyonu, Rekombinant enzimin saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Human Paraoxonase 1 (pon1) gene cloning, expression in Pichia pastoris, purification and characterization of Recombinant enzyme

    YAĞMUR ÜNVER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyoteknolojiAtatürk Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ESABİ BAŞARAN KURBANOĞLU

    PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN

Geri Dön