Geri Dön

Escherichia coli sialiltransferaz geninin klonlaması, ekspresyonu ve yapı-işlev ilişkileri

Cloning, expression and structure-function relationship in sialyltransferase gene of escherichia coli

  1. Tez No: 149601
  2. Yazar: YOSUN MATER
  3. Danışmanlar: PROF.DR. FÜSUN GÜMÜŞEL, PROF.DR. SABİRE KARAÇALI
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2004
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ege Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 146

Özet

ÖZET Hücre yüzeylerinde yer alan sialik asitler canlıda tanıma, tutunma, farklılaşma ve immün düzenleme gibi önemli biyolojik olaylarda işlevsel olan polisakkaritlerdir. Prokaryotlarda sialik asit ve metabolizması üzerine yapılan çalışmalar, kapsül senteziyle ilintili gen bölgelerinde odaklanmıştır. E. coli K92'nin kapsüler polisakkariti -8-NeuAca2 ve -9-NeuAca2 bağlarım içerir. Bu tez çalışmasında a-2,8 ve a-2,9 bağlı polimerleri sentezleme yeteneği taşıdığı bilinen tek enzim olan sialitransferazın (ST) sentezinden sorumlu neuS geni, E. coli K92 genomik DNA'sından klonlanmıştır. PCR ürünü olan 1.23 kb büyüklüğündeki parça pUC vektörüne yerleştirilmiş ve protein E. coli JM109 soyunda eksprese edilmiştir. Yaklaşık 47.5 Kda büyüklüğünde bir bandın varlığı yapılan SDS/PAGE analizlerinin bazılarında gözlenmiş ancak anti-ST antikorları sağlanamadığından Western Blot analizi ile doğrulanamamıştır. neuS genini taşıyan plazmit, bu çalışmada gen kaynağı olarak kullanılan E. coli K92 soyunun transforme edilmesinde de kullamlmıştır. Rekombinant soylarla yapılan elektron mikroskobik analizler, rekombinant K92'de ciddi bir yüzey farklılığının oluşmamasına karşın, E. coli JM109-ST hücrelerinde yüzey sialik asitlerinin kaim bir tabaka oluşturduklarına işaret etmiştir. Tez çalışmasının ikinci aşamasında, bakteriyel ST yapı işlev ilişkilerinin belirlenmesine yönelik çalışmalara katkıda bulunmak amacıyla 3 farklı yönlendirilmiş mutagenez çalışması yapılmıştır. Bunlardan ikisi başarılı olmuş ve toplam 409 amino asitten oluşan E. coli K92 ST'mda K173N, K175E, P176A ve W185G amino asit değişiklikleri yapılmıştır. Mutagenez çalışmalarının sonuçlan, W185G değişikliğinin enzimin polimerizasyon aktivitesini etkilediğine ve K173N, K175E, P176A değişimlerinin gerçekleştirildiği ve olası membran bağlanma bölgelerinden birisinde yer alan KKKP motifinin enzimin hücre zarına bağlanmasında işlevsel olduğuna ve belirtilen mutasyonlann bu bağlantıyı bozduğuna işaret etmiştir. Mutant klonlarda yüzey değişikliklerinin ötesinde çeşitli morfolojik farklılıklar saptanmıştır.

Özet (Çeviri)

vn ABSTRACT Sialic acids are cell surface polysaccharides functional in biological processes such as recognition, binding, differentiation and immune regulation. The research activities targeting sialic acid and its metabolism have been mainly focussed on the genes related to capsule synthesis. Capsular polysaccharide of E.coli K92 consists of -8- NeuAcoc2 and -9-NeuAcoc2 bonds. In this study, neuS gene, responsible for the synthesis of the sialyltransferase which is unique with its ability to synthesize a- 2,8 and a- 2,9 linked polymers among the know gylcosyltransferases, was cloned from E. coli K92 genomic DNA. The PCR product of 1.23 kbp long fragment was inserted into pUC 19 vector and the protein expression was achieved in E. coli JM109. The presence of 47.5 kDa protein band was observed in some of the SDS/PAGE analyses, but it was not confirmed by Western Blotting since anti-ST antibodies can not be obtained. The plasmid carrying neuS gene was also used in transformation of E. coli K92. Electron microscopical analyses in recombinant strains show that although serious surface differences was not seen in recombinant K92 strains, formation of a thick layer by surface sialic acids was seen in JM109-ST cells. At the second step, three different site-directed mutagenesis studies was performed to determine bacterial ST structure-function relationships. Two of them was successful and K173N, K175E, P176A and W185G amino acid substitutions were introduced into 409 amino acids long K92-ST. The results of mutagenesis studies indicated that W185G substitution affected the polymerization activity of the enzyme and the KKKP motif, in which K173N, K175E, PI 76 A substitutions were realized, located on one of the possible membrane binding sites, was functional in the binding of the enzyme to the cell membrane and the binding was abolished by the corresponding mutations. In mutant clones, besides the surface differences, several morphological changes were also detected.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    179262

    Olası bakteriyel hücre iskelet sisteminin immün floresan boyama yöntemi ile gösterilmesi

    Display of potential bacterial cytoskeletal system by immune fluorescence staining method

    CEREN BÜYÜKKAYALAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. YOSUN MATER

  2. Tez No

    80058

    Kedi ve köpeklerden izole edilen Escherichia coli suşlarının biyokimyasal, patojenite ve toksijenite özelliklerinin araştırılması

    Biochemical, toxigenic and pathogenic characteristics isolated of Escherichia coli strains from dogs and cats

    SİBEL ÖZKÖK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    Veteriner HekimliğiAnkara Üniversitesi

    Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HAKAN YARDIMCI

  3. Tez No

    80502

    Escherichia Coli'nin hemaglütinasyon yapma özelliği ve hastalık tanısındaki değeri

    Başlık çevirisi yok

    SÜREYYA ERDARCAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1985

    Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi

    Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖMER KASIMOĞLU

  4. Tez No

    83629

    Et ve et ürünlerinde escherichia coli 0157:H7

    Escherichia coli 0157 : H7 in meat and meat products

    NEŞE ATILGAN (ÖMEROĞLU)

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    Gıda MühendisliğiAtatürk Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MÜKERREM KAYA

  5. Tez No

    84396

    Deniz suyunda dezenfektan kimyasal maddelerin escherichia coli ML30 ve salmonella typhimurium LT2 bakterilerinin protein sentezine olan etkileri

    The Effects of dizinfectant chemicals on protein synthesis of escherichia coll ML30 and salmonella typhimurium LT2 in sea water

    CİHAN DARCAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    BiyolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. REŞİT ÖZKANCA

Geri Dön