Optimisation of stationary and mobile phases for the purification of Pst I endonuclease by ion exchange chromatography
Pst I endonükleazının iyon değişimi kromatografisi yöntemiyle saflaştırılmasında durgun ve hareketli fazların uygunluğunun incelenmesi
- Tez No: 152563
- Danışmanlar: PROF. DR. KUTLU ÜLGEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2004
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 137
Özet
ÖZET Pst I ENDONUKLEAZININ İYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFISI YÖNTEMİYLE SAFLAŞTIRILMASINDA DURGUN VE HAREKETLİ FAZLARIN UYGUNLUĞUNUN İNCELENMESİ Bakteriyel endonükleazlann özel bir sınıfı olan restriksiyon endonükleazları, çift zincir DNA üzerindeki spesifik nükleotid dizilerini tanıyabilir ve çift sıralı kesimler üretebilir. Providencia stuartii 164'ün ürettiği Pst I endonükleazı, DNA üzerinde simetrik 5'-C-T-G-C-A-G-3' and 3'-G-A-C-G-T-C-5' nükleotid dizinini kesen bir restriksiyon enzimidir. Bugüne kadar Pst I endonükleazının saflaştırılması diyaliz, çökeltme ve iyon değişimi kromatografisi gibi çeşitli yöntemlerle başarılmıştır. Bu çalışmada ise Waters Cation Exchange Protein Pak; SP 8HR-AP1 ve Anion Exchange Protein Pak; DEAE 15HR-AP1 iyon değişimi kolonları kullanılarak bu kolon tiplerinin Pst I endonükleazının geri kazanılması ve ayrılması üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Pst I endonükleazının saflaştırılması, yüksek performanslı iyon değişimi kromatografı yöntemiyle Sodyum Asetat (pH: 5.0), Potasyum Fosfat (pH: 7.0), Tris (pH: 8.0) ve L-Histidine (pH: 6.0) hareketli fazlan kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Katyon değişimi kolonu kullanılarak yapılan deneyler daha iyi sonuçlanmış, fakat aktif enzim kazanımı bakımından ise anyon değişimi kolonuyla yapılan deneylerden çok daha iyi verimler elde edilmiştir. Aktif enzimin geri kazanılması açısından L-Histidine (pH: 6.0) hareketli fazı, bu tezde kullanılan diğer hareketli fazlarla kıyaslanıldığında en uygun hareketli faz olarak bulunmuştur. Yüksek performanslı iyon değişimi kromatografisi ile deneyler gerçekleştirildikten sonra geri kazanılmış enzim fraksiyonlarının aktivitesi ve saflığı sırasıyla agaroz jel elektoforezi ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yöntemleriyle kontrol edilmiştir ve beşer dakikalık aralarla deney boyunca toplanmış olan nümunelerdeki protein konsantrasyonu ise Bradford testiyle tespit edilmiştir. Kalite kontrol testi ile de yapışmayı engelleyebilecek ya da DNA son ucunu küçültecek olan safsızlık yapıcı maddelerin varlığı kontrol edilmiştir.
Özet (Çeviri)
IV ABSTRACT OPTIMISATION OF STATIONARY AND MOBILE PHASES FOR THE PURIFICATION OF Pst I ENDONUCLEASE BY ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY Restriction endonucleases, a special class of bacterial endonucleases, can recognize specific nucleotide sequences in dublex DNA and produce double stranded cleavages. Pst I is a restriction enzyme of Providencia stuartii 164 which cleaves the symmetrical hexanucleotide sequence: 5'-C-T-G-C-A-G-3' and 3'-G-A-C-G-T-C-5'. Purification of Pst I endonuclease has been so far accomplished by the procedures such as dialysis, precipitation and ion exchange chromatography. In this study, the effects of the column types on the separation and recovery of Pst I endonuclease were investigated by employing Waters Cation Exchange Protein Pak; SP 8HR-AP1 and Anion Exchange Protein Pak; DEAE 15HR-AP1 columns. The recovery of Pst I endonuclease was optimized by high-performance ion exchange chromatography using Sodium Acetate (pH: 5.0), Potassium Phosphate (pH: 7.0), Tris (pH: 8.0) and L- Histidine (pH: 6.0) buffers. The experiments with the cation exchange column resulted in better resolutions. However, in terms of the active Pst I endonuclease recovery, anion exchange column results in better yields than those obtained in cation exchange column. L- Histidine (pH: 6.0) buffer is found to be the most suitable mobile phase for the active enzyme recovery compared to other three buffers used in this thesis. The activity and purity of the recovered enzyme fractions were checked by electrophoretic techniques of agarose gel electrophoresis and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, respectively and the protein concentration in samples collected during the experiments in 5-minute interval, was determined by the Bradford dye binding method. Pst I restriction endonuclease was also tested by Quality Control Test for the presence of contaminants that would inhibit ligation or degrade termini.
Benzer Tezler
- Safra asitlerinin biyolojik örneklerden tayini için Sk-kS/KS yönteminin geliştirilmesi ve validasyonu
Development and validation of LC-MS/MS method for the determination of bile acids from biological samples
KADRİ GÜLEÇ
Doktora
Türkçe
2023
Eczacılık ve FarmakolojiAnadolu ÜniversitesiAnalitik Kimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EROL ŞENER
- Farklı polaritelere sahip amid-silika kolon dolgu materyallerinin sentezi ve HPLC ile çeşitli polar bileşiklerin ayrılmasında kullanılması
Synthesis of amid-silica stationary phases having different polarities and using in seperation of a variety of polar compounds by HPLC
HAYRİYE ARAL
- Yeni amid - silika kolon dolgu maddesi kullanılarak sitokininlerin hplc ile ayrılması ve optimizasyonu
Separation and optimization of cytokinins with using new amide - silica stationary phase with hplc
DUYGU HAŞİMİ
- Akıllı yansıtıcı yüzey destekli telsiz haberleşme sistemi ve insansız hava aracı konumlandırma
Reconfigurable intelligent surface-assisted wireless communication system and unmanned aerial vehicles positioning
EMİR ASLANDOĞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesiİletişim Sistemleri Ana Bilim Dalı
DR. MEHMET AKİF YAZICI
- Gıda takviyesi tabletlerinde bulunan glukozamin etken maddesinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile tayini için metot optimizasyonu ve validasyonu
Method optimization and validation for the determination of glucosamine active ingredient in food supplement tablets by high performance liquid chromatography (HPLC) method
AYŞEGÜL SEMİZ