Expression, purification, and functional analysis of adenovirus type 5 E4 ORF3 protein
Adenovirüs tip 5 E4 ORF3 proteininin ekspresyonu, pürifikasyonu ve fonksiyonel analizi
- Tez No: 153558
- Danışmanlar: PROF.DR. FERİDE SEVERCAN, PROF.DR. THOMAS DOBNER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: adenovirus, gen terapisi, onkogenez, E4orf3, FTIR vıı, adenovirus, gene therapy, oncogenesis, E4orf3, FTIR
- Yıl: 2004
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 136
Özet
oz ADENOVIRUS TİP 5 E4 ORF3 PROTEİNİNİN EKSPRESYONU, PÜRİFİKASYONU VE FONKSİYONEL ANALİZİ KOYUNCU, Emre Yüksek Lisans, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Feride Severcan Ortak Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Thomas Dobner Eylül 2004, 119 sayfa Bu çalışmada adenovirus tip 5 (Ad5) E4orf3 proteininin yapısal ve fonksiyonel özellikleri biyofiziksel ve biyokimyasal yöntemlerle incelenmiştir. Ad5 günümüzde en çok kullanılan gen terapisi vektörlerinden biridir. Fakat bazı adenovirus proteinleri onkojenik özellikler taşımaktadır ki bu güvenlik açısından risklidir. E4orf3 Ad5'in onkoproteinlerinden biridir. Bu protein, virüs enfeksiyon döngüsünde de önemli roller üstlenmektedir ve terapi vektörü için yararlıdır. Bu nedenle, bu proteinin fonksiyonlarının aydınlatılması, verimli ve güvenli adenovirus vektörlerinin geliştirilmesi açısından çok önemlidir. E4orf3'ün fonksiyonları hakkındaki çoğu bilgi, proteinin mutasyonal analizi sonucu elde edilmiştir. Protein, solüsyonda erimez davranışı nedeniyle daha önce ekspres edilememiş ve saflaştırılmamıştır. Bu nedenle, bu çalışmada E4orf3 proteininin ekspresyonunun optimize edilmesine odaklan ı İm ıştır. Sonuç olarak E4orf3, Glutatyon-S-Transferaz (GST) füzyon proteini halinde vıçözünür olarak elde edilmiş ve GST afinite kromatografisi ile ilk kez saflaştırı İm ıştır. Ardından, E4orf3'ün dört değişik proteinle, DNA-PK, Aup1, E1B-55 kDa ve E4orf6'yla interaksiyonu GST-Pulldown tekniğiyle detaylı bir şekilde incelenmiştir. Bu çalışmalarda E4orf3'ün Aup1, E1B-55 kDa ve E4orf6'yla in vitro interaksiyonu gösterilmiş, ve proteinin C-terminalinin bu interaksiyonlardan sorumlu olduğu saptanmıştır. Son olarak, E4orf3 hakkındaki temel yapısal bilgiler, glutatyon sefaroza bağlı füzyon proteininin direk olarak Fourier Transform Infrared (FTIR) spektroskopisiyle analizi sonucu ilk kez elde edilmiştir. Saflaştırılan E4orf3, hidrofobik özellikleri nedeniyle glutatyon sefarozdan ayrılamamış olduğundan, proteinin ikincil yapıları glutatyon, su ve GST bantları ayıklandıktan sonra belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT EXPRESSION, PURIFICATION, AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF ADENOVIRUS TYPE 5 E4 ORF3 PROTEIN KOYUNCU, Emre M.Sc, Department of Biology Supervisor :Prof. Dr. Feride Severcan Co-Supervisor :Prof. Dr. Thomas Dobner September 2004, 119 pages In this study, structural and functional aspects of adenovirus type 5 (Ad5) E4orf3 protein were analyzed by biophysical and biochemical methods. Ad5 is one of the mostly used gene therapy vectors to date. However, some of its proteins possess oncogenic potential and their presence comprises safety risks. E4orf3 is one of the oncoproteins of Ad5. It also takes important roles in viral infection, and is beneficial for therapy vectors. Therefore, understanding the functions of E4orf3 is very important for developing efficient and safe adenovirus vectors. Most of the present knowledge about the functions of E4orf3 comes from its mutational analysis. It has never been expressed or purified successfully due to its extreme insolubility. Therefore, this study focused on the optimization of expression of E4orf3 protein. As a result, full-length E4orf3 was obtained in soluble form as a Glutathione-S-transferase (GST) fusion protein and purified IVby GST affinity chromatography for the first time. Subsequently, the interaction of E4orf3 with four different proteins, DNA-PK, Aup1, E1B-55 kDa and E4orf6 was analyzed in detail by GST-pulldown technique. In these experiments, E4orf3 was shown to associate with Aup1, E1B-55 kDa and E4orf6 in vitro, and the C-terminal of E4orf3 was determined to be responsible for these interactions. Finally, basic structural information about E4orf3 protein was also obtained for the first time by the direct analysis of the fusion protein in glutathione beads with Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy. Since the purified E4orf3 protein could not be separated from the glutathione beads due to its hydrophobic regions, the secondary structures in this protein were determined after subtracting glutathione and H20 absorption bands, and the GST moiety.
Benzer Tezler
- Functional and structural analysis of catalase-phenol oxidase from Scytalidium thermophilum
Scytalidium thermophilum katalaz-fenol oksidazının fonksiyonel ve yapısal analizi
YONCA YÜZÜGÜLLÜ
Doktora
İngilizce
2010
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MİCHAEL J. MCPHERSON
PROF. DR. ZÜMRÜT B. ÖGEL
- Functional analysis of vus (variant of uncertain significance) of human muts homolog 2/6 (hMSH2/6) proteins
İnsan muts homolog 2 ve 6 (hMSH2/6) proteinlerinde bulunan klinik önemi belirsiz varyantlarin fonksiyonel analizi
CELİL MERT GÜL
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Discovery of novel enzymes using proteomic approaches
Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi
MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
Doktora
İngilizce
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ
- Expression, purification and preliminary functional characterization of the acidianus two-tailed virus TnpB endonucleases
Acıdıanus ikı kuyruklu vırüsü TnpB endonükleazlarının ekspresyonu, saflaştırılması ve öncül fonksıyonel karakterızasyonu
ARWA SALEH BURGEIA
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
Biyokimyaİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSE OKE
- Expression, purification, and characterization of soluble recombinant TNFR1
Çözünür rekombinant TNFR1'in üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
DERYA HATİPOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY