Functional analysis of vus (variant of uncertain significance) of human muts homolog 2/6 (hMSH2/6) proteins
İnsan muts homolog 2 ve 6 (hMSH2/6) proteinlerinde bulunan klinik önemi belirsiz varyantlarin fonksiyonel analizi
- Tez No: 900893
- Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 105
Özet
Lynch sendromu (LS) veya kalıtsal polipsiz kolorektal kanser (HNPCC), kolorektal kanser ve ilgili kanserler riskini artıran genetik bir semptomdur. Lynch sendromunun ortaya çıkmasında DNA uyuşmazlığı onarım genlerinde MSH2, MSH6, MLH1 ve PMS2'de gözlemlenen germ hattı genetik varyantları birincil dereceden rol oynamaktadır. Ökaryotlarda MSH2 ve MSH6 proteinleri, DNA'daki uyumsuzlukları tanımaktan ve uyumsuzluk onarımı için gerekli proteinleri bir araya getirmekten sorumlu olan MutSα kompleksini oluşturmaktadır. Belirsiz öneme sahip varyantların (VUS) fonksiyonel sonuçlarının tanımlanması, morbidite ve mortaliteyi azaltmak için LS hastalarını uygun sürveyans programlarına kaydetmede çok önemlidir. Bu çalışmada kalıtsal kolorektal kanserin Türk popülasyonundaki mutasyon profili, kolorektal kanserli 371 hastada 26 kansere yatkınlık geninin varyasyon spektrumunun, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak analiz edilmesiyle belirlenmiştir. Tespit edilen varyantlar, Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Koleji (ACMG) standartlarına göre yorumlanmıştır. MSH2 ve MSH6 lokusları, nükleotit değişiminin protein fonksiyonu üzerindeki etkisini belirlemek için önemi bilinmeyen varyantlar (VUS) açısından taranmıştır. Uyumsuzluk onarımı bakımından eksik hücre hattı (LoVo), hMSH2 vahşi tip (MSH2-WT) ve hMSH6 vahşi tip (MSH6-WT) genleri ve seçilmiş mutasyona uğramış alt klonlar (MSH6-R577C, MSH6-S1279N ve MSH2-A733T) ile geçici olarak transfekte edilmiştir. Etkileşen proteinlerin mRNA ifadesindeki değişiklikler ve protein ifadesi araştırılmıştır. Sonuç olarak, MSH2-WT'ye kıyasla LoVo hücreleri MSH2-A733T ile transfekte edildiğinde hMSH6 gen ekspresyonunun azaldığı gözlemlenmiştir. Aşağı akış ve etkileşim ortağı proteinlerinin ekspresyon seviyelerinin, mutasyona uğramış protein formları varlığında önemli ölçüde etkilenmediği görülmüştür. İn-vitro bağlanma deneyleri, mutasyonların MSH2 ve MSH6 arasındaki etkileşimin bozulmadığını göstermiştir. HEK293T hücrelerinden üretilen saflaştırılmış MSH2-WT ve MSH2-A733T proteinleri stabil formlarda elde edilememiştir. Bakteri konağının yabanıl tip gen dizilerini taşıyan iki vektörle eş zamanlı transforme edilmesi sonucu proteinlerin çözünür formda üretilmesi sağlanmış ve saflaştırma protokolü oluşturulmuştur. Ancak proteinlerin boyutlarının büyüklüğünden kaynaklanan düşük verimden dolayı bu metodun domain spesifik çalışmada kullanılabileceği ve optimize edilmesi gerektiğine karar verilmiştir. Seçilen klinik önemi bilinmeyen varyantların yeniden sınıflandırılabilmesi için fonksiyonel çalışmaların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. MSH2/MSH6'da tespit edilen VUS'ların yeniden sınıflandırılması, varyant sınıflandırma doğruluğunu artırma, risk değerlendirmesini artırma, tavsiye edilen klinik karar vermeyi kolaylaştırma ve etkilenen bireyler ve aileleri için daha doğru genetik danışmanlık sağlama potansiyeline sahiptir. Kişiselleştirilmiş yönetim stratejilerinin uygulanması, Lynch sendromu popülasyonlarında kanser mortalitesini ve morbiditesini etkili bir şekilde azaltabilir.
Özet (Çeviri)
Lynch syndrome (LS) or hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) is a genetic condition that raises the risk of colorectal cancer and related cancers. Germline genetic variants of the DNA mismatch repair genes MSH2, MSH6, MLH1, and PMS2 are primarily responsible for its occurrence. In eukaryotes, MSH2 and MSH6 combine to form the MutSα complex, which is responsible for recognizing mismatches and assembling the necessary proteins for mismatch repair. Defining the functional consequences of variants is crucial in enrolling LS patients in appropriate surveillance programs to reduce morbidity and mortality. Herein, the mutation profile of hereditary colorectal cancer in the Turkish population was determined by analyzing the variation spectrum of 26 cancer susceptibility genes in 371 patients with colorectal cancer using next-generation sequencing technology. The detected variants were interpreted based on The American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) recommendations. The MSH2 and MSH6 loci were screened for variants of unknown significance (VUS) to determine the effect of nucleotide substitution on protein function. Mismatch repair deficient cell line (LoVo) was transiently transfected with hMSH2 wild-type (MSH2-WT) and hMSH6 wildtype (MSH6-WT) genes and selected mutated subclones (MSH6-R577C, MSH6- S1279N, and MSH2-A733T). Regulation of mRNA expression and protein expression of interacting proteins were investigated, which showed hMSH6 gene expression was decreased when LoVo cells were transfected with MSH2-A733T compared to MSH2- WT. Expression levels of the downstream targets and interaction partner proteins were not affected significantly due to mutated forms of proteins. In-vitro binding assays showed that mutations did not affect the interaction between MSH2 and MSH6. Purified MSH2-WT and MSH2-A733T proteins that were produced from HEK293T cells were not obtained in stable forms. Bacterial co-expression of genes exhibited soluble protein production, and purification method for wild type proteins was promoted. However, due to the low stability of high molecular weighted proteins, it was decided that this method could be used in domain-specific studies with improvements. In order to reclassify clinical importance of the selected VUS, functional studies are needed to be improved. Reclassification of VUS in MSH2/MSH6 has the potential to improve variant classification accuracy, increase risk assessment, facilitate recommended clinical decision making, and provide more accurate genetic counseling for affected individuals and their families. Consequently, implementing personalized management strategies can effectively reduce cancer mortality and morbidity in Lynch syndrome populations.
Benzer Tezler
- Investigation of structural differences between wild-type and mutant forms of mutsα by molecular dynamics simulations
Mutsα heterodimerinin yabanıl tip ve mutant formları arasındaki yapısal farklılıklarının moleküler dinamik simülasyonları ile incelenmesi
CLARA XAZAL BURAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MERT GÜR
- Functional characterization and reclassification of genomic variants of uncertain significance in hereditary cancers
Kalıtsal kanserlerde klinik önemi bilinmeyen genomik varyantların fonksiyonel karakterizasyonu ve yeniden sınıflandırılması
SEVDİCAN ÜSTÜN YILMAZ
Doktora
İngilizce
2024
GenetikAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar ÜniversitesiMedikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UĞUR ÖZBEK
PROF. DR. MELTEM MÜFTÜOĞLU
- Investigation of novel genes and functional roles in MEFV negative FMF patients through next-generation sequencing
MEFV negatif ailesel Akdeniz ateşi hastalarında yeni nesil dizileme yöntemiyle özgün genlerin ve işlevlerinin araştırılması
MERVE ÖZKILINÇ ÖNEN
Doktora
İngilizce
2023
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI
- Meme kanseri olgularında genomdaki klinik önemi bilinmeyen değişiklikler sinyal yolakları ile ilişkili midir?
Are changes of unknown clinical significance in the genome related to signaling pathways in breast cancer cases?
SEZEN GÜNTEKİN ERGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
GenetikBaşkent ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FERİDE İFFET ŞAHİN
- BRCA2 genindeki klinik önemi bilinmeyen varyantların patojenitesinin in silico analizler ile değerlendirilmesi ve klinik korelasyonu
Evaluation of the pathogenicity of variants of uncertainsignificance i-n the BRCA2 gene through in silico analysesand clinical correlati̇on
CANAN CEYLAN KÖSE
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2024
GenetikÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATMA SILAN