Sıcaklık ve PH duyarlı polikatyonlarla tütün protoplastlara DNA transferi
DNA transfer to the tobacco protoplasts by the aid of temperature and PH sensitive polycations
- Tez No: 155300
- Danışmanlar: PROF.DR. ERHAN PİŞKİN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Tütün Bitki Hücreleri Gen aktarımı, Sıcaklık-Duyarlı Polikatyonik Polimer, Nicotiana tabaccum Kallus ve hücre kültürü, Elektroporasyon, B- glukosidaz (GUS) Gen Anlatımı, Tobacco Plant Cells Gene Transformation, Temperature-Sensitive Policationic Polymers, Nicotiana tabaccum Callus and Cell Culture, Electroporation, B- glukosidaz (GUS) Gene Expression
- Yıl: 2004
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 107
Özet
SICAKLIK VE PH DUYARLİ POLI KATYONLARLA TUTUN PROTOPLÂSTLARÂ DNA TRANSFERİ Gonca Koksal ÜLKER OZ Bu çalışmanın amacı değişik formdaki tütün Nicotiana tabaccum hücrelerine sıcaklık duyarlı polikatyonlar kullanılarak gen aktarımının incelenmesidir. Bu amaçla taşıyıcı olarak satın alma yoluyla temin edilen ortalama molekül ağırlığı 25kDa olan doğrusal ve dallanmış polietilenimin (PEI) ve bunların araştırma kapsamında sentezlenen sıcaklık duyarlı poli(N-izopropilakrilamid) {poli(NIPA)} ile kopolimerleri kullanılmıştır. Bu polimerik taşıyıcıların B-glukosidaz geni taşıyan plazmid DNA ile konjugatları oluşturulmuş ve N. tabaccum hücrelerine aktarımı incelenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında karboksil uçlu poli(NIPA) sentezlenmiş ve bunun PEI ile kopolimerleri, suda çözünür karbodiimit (EDAC) varlığında transesterifikasyonla hazırlanmıştır. Polimerler çeşitli yöntemler ile karakterize edilmiştir. FTIR ve 1H-NMR spektrumlan polimer oluşumlarını göstermiştir. GPC ile poli(NIPA) homopolimeri ve poli(NIPA)/PEI25L ve poli(NIPA)/PEI25D kopolimerlerinin ortalama molekül ağırlıkları sırasıyla 3087, 53100, ve 55200 olarak bulunmuştur. Sıcaklık duyarlı poli(NIPA) homopolimerinin LCST değeri 31.0°C iken poli(NIPA)/PEI25L ve poli(NIPA)/PEI25D kopolimerlerinin LCST değerleri sırasıyla 36.6°C ve 39.6°C olarak saptanmıştır. B- glukosidaz geni taşıyan plazmid DNA'nın PEI homopolimerleri (PEI25L ve PEI25D) ve bunların poli(NIPA) ile kopolimerleri (poli(NIPA)/PEI25L ve poli(NIPA)/PEI25D) kopolimerler ile konjugatları hazırlanmıştır. Plazmid DNA, bu homo ve kopolimerlerinin ve bunların farklı polimer/plazmid DNA kullanılarak hazırlanmış konjugatlarının yükleri ve boyutları bir Zeta Sizer kullanılarak belirlenmiştir. Dallanmış PEl'nın doğrusal olana göre daha fazla pozitif yük taşıdığı ve yükün kopolimerizasyonla düştüğü gözlenmiştir. Plazmid DNA negatif yüklüdür, ancak bunun PEI homopolimerleri ve kopolimerleri ile yaptığı konjugatların yükleri pozitifir ve polimer/plazmid DNA oranı artışı ile artmaktadır. Konjugat oluşumu sırasında plazmid DNA'nın sıkılarak kondense olduğu gözlenmiştir. Polimer/plazmid DNA oranı 6 olduğunda en küçük boyutlu konjugatlar elde edilmiştir. Oran 8 ve 10 iken ise yığılmalar sonucu konjugat boyutu mikron boyutlara çıkmıştır. Sıcaklık 30°C'e çıkartıldığında sıcaklık duyarlı kopolimerlerin boyutunun daha da düştüğü11 gözlenmiştir. Yapıları toksisite deneylerinde taşıdıkları pozitif yük ile orantılı olarak homo ve kopolimerlerinin artan oranlarda toksisite gösterdikleri belirlenmiştir. Kopolimerizasyonun toksisiteyi azalttığı, polimer/plazmid DNA oranının artışı, ile toksisitenin önemli oranda arttırdığı görülmüştür. Gen aktarım çalışmalarında N. tabaccum kallusları, hücre agregatları ve hücre süspansiyonlarına aktarım ve gen anlatımı incelenmiştir. Histolojik ve fluorometrik GUS analizleri polimerik yapıda dallanmanın ve polimer/plazmid DNA oranının artmasının pozitif yükü ve buna bağlı olarak toksisiteyi arttırması sonucu daha düşük gen aktarım ve ekspresyonun verimlerinin ortaya çıktığını göstermiştir. Kopolimerizasyon ve bunun sonucu ortaya çıkan sıcaklık duyarlılığı nedeniyle hem pozitif yükün hem de konjugat boyutunun azalması sonucu verimin yükseldiği görülmüştür. Sonuç olarak, sıcaklık-duyarlı, polikatyonik poli(NIPA)/PEI25L'nin in vitro koşullarda Nicotiana tabaccum hücrelerine en yüksek verim ve en düşük toksisite ile gen aktarımı ve gen ekspresyonu sağlayan polimerik taşıyıcı olduğu bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
Ill DMA TRANSFER TO THE TOBACCO PROTOPLASTS BY THE AID OF TEMPERATURE AND PH SENSITIVE POLYCATIONS Gonca Koksal ÜLKER ABSTRACT The aim of this study, the investigation of DNA uptake and gene expression in different tobacco plant cell lines by electroporation in order to use cationic homo and stimuli-responsive copolymer as a DNA carrier. In this study commercially obtained PEI with 25 kDa molecular weight with two different structures (linear and branched) and copolymers with synthesized stimuli-responsive carboxyl ended poly(NIPA) (3 kDa) were used. The homo and copolymers made complexes with Plazmid DNA expressing B-glucosidase (GUS) and investigated DNA uptake and gene expression of complexes in Nicotians tabaccum tobacco cells. First of all, carboxyl ended poly(NIPA) (3 kDa) was synthesized and poly(NIPA)/PEI copolymers were obtained in the presence of water-soluble carbodiimide (EDAC) by transesterification. After copolimerization, polimers were characterized by using different methods. FTIR ve 1H-NMR spectrums showed poli(NIPA)/PEI copolimerization. By GPS, poli(NIPA) homopolymer and poli(NIPA)/PEI25L and poli(NIPA)/PEI25D copolymers avarage molecular weight were obtained as 3087, 53100 and 55200. While the LCST of poli(NIPA) was 31.0°C, the LCST of poli(NIPA)/PEI25L and poli(NIPA)/PEI25D copolymers were found as 36.6°C and 39.6°C. The complexes of. PEI homopolimers (PEI25L and PEI25D) and copolimers (poli(NIPA)/PEI25L, poli(NIPA)/PEI25D) with plazmid DNA expressing 6- glucosidase (GUS) were prepared. Size and charge of PEI25L and PEI25D homo and complexes of poli(NIPA)/PEI copolymer/Plazmid DNA was obtained by Zeta Sizer. The complex formed with branched PEI showed higher positive charge and copolymerization caused a decrease in positive charge. Plazmid DNA has negative charge, but its complex with homo and copolymers showes positive. The polimer/plasmid DNA complex charge becomes much more positive by the polimer/plazmid DNA concentration increases. During conjugation, plazmid DNA was observed condense. In the concentration of complexes was 8 and 10, the size ofIV complexes was dramatically increased and observed in micron size. It was estimated that the size of copolymer/plazmid DNA complexes decreased when temperature increased upto 30°C because the copolymer had a temperature sensitivity. In addition, copolymerization with NIPA caused a decrease in cytotoxicity, interestingly. Cytotoxicity studies showed that the cytotoxicity has a correlation with the positive charge of homo and copolymers and effected badly by increasing the concentration of polimer/plazmid DNA positive charge increases. The investigation of DNA uptake and gene expression was observed into Nicotiana tabaccum callus, cell suspention and cell agregation. Histological and fluorometric GUS analysis showed that, branching and concentration of complexes dramaticaly increased positive charge of complexes and the result of positive charge high cytotoxicity was observed. In the high concentration of complexes DNA uptake and gene expression efficiency was decrease as cytotoxicity increased by positive charge. Copolimerization and result of stimuli-responsive character of copolymer, the size and positive charge was become lower and as a result of this decreasing, DNA uptake and expression efficiency was observed higher. As a result, temperature-sensitive, polycationic poly(NIPA)/PEI25L was selected as the most efficient and less toxic carrier for Nicotiana tabaccum cells, in vitro.
Benzer Tezler
- Sıcaklık ve pH-duyarlı poli (vinil eter) hidrojellerin sentezi ve biyolojik karakterizasyonu
Synthesis and biological characterization of temperature and pH-sensitive poly (Vinly ether) hydrogels
AYFER ARI
Yüksek Lisans
Türkçe
1998
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
- Sıcaklık ve ph duyarlı aljinat bazlı mikrokürelerin tasarımı ve indometasin salımında kullanımı
Conception of temperature and ph sensitive alginate base microspheres and use of them indomethacine release
GÜLCAN KÜÇÜKBALCI
- Sıcaklık ve pH duyarlı polimerik sistemlerin üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of temperature and pH-sensitivepolymeric systems
İSMAİL KUTLUGÜN AKBAY
Doktora
Türkçe
2020
Polimer Bilim ve TeknolojisiMersin ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TONGUÇ ÖZDEMİR
- Sıcaklık ve pH duyarlı polimerzomların hazırlanması
Preperation of temperature and pH responsive polymersomes
SEYİTHAN KANSIZ
- Ph duyarlı latekslerin sentezi ve florometrik karakterizasyonu
Synthesis and characterization of ph sensitive latexes
YALAZ YALÇIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. ALİ TUNCEL