Geri Dön

Heksozaminidaz enzimi alfa-altbirim genindeki 12 bazçiftlik delesyon mutasyonunun heksozaminidaz enzimi beta-altbirim geninde in vitro mutagenez ile oluşturulması ve proteine etkilerinin araştırılması

Reproducing the 12 bp deletion mutation of alpha-subunit gene of hexosaminidase into the beta-subunit gene of hexosaminidase by in vitro mutagenesis and analysing its effects on protein

PDF İndir

  1. Tez No: 156910
  2. Yazar: İNCİLAY SİNİCİ
  3. Danışmanlar: PROF.DR. ASUMAN ÖZKARA
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biochemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Tay-Sachs, heksozaminidaz, 12 bazçiftlik delesyon mutasyonu, protein katlanması, in vitro mutagenez. uygunluğu belirlemede önemlidir, Tay-Sachs, hexosaminidase, 12 bp deletion mutation, protein folding, in vitro mutagenesis
  7. Yıl: 2004
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 168

Özet

GM2 gangliozidoz, N-asetil~P~heksozaminidaz (EC 3,2,1,52) A (Hex A)'nın a veya P-altbirimlerini kodlayan genler veya GM2 aktivatör protein genindeki bozukluk nedeni ile oluşan bir grup lizozomal depo hastalığıdır. Eksikliğinde GM2 ganglioidozun ortaya çıktığı Hex enziminin, a ve P-altbirimleri %60 dizi benzerliği gösterdiği için, Hex A ve Hex B genlerinin ortak bir ata genden evrimleştiklerine inanılmaktadır. Bu nedenle a ve |3-atbirimlerinin korunmuş fonksiyonel domainler ile çok benzer üç boyutlu yapıyı paylaştıkları düşünülmektedir. Bu çalışmada, Hex'de yapı-fonksiyon ilişkilerini ve mutasyonun yeni tedavi yöntemlerine uygunluğunu belirlemek üzere, Türk toplumunda tanımlanmış Tay-Sachs hastalarında en sık görülen ve oc-altbirimin pro- şekilde kalmasına neden olan 12 bazçiftlik (bç) delesyon mutasyonu (1267-1279) in vitro mutagenez ile P-altbirim cDNA'smda oluşturuldu. Aynı zamanda Hex ekspresyonu için promotor etkinliği araştırıldı. îki tanesi HCMV IE promotoru taşıyan, diğeri EF-loc promotoru taşıyan 3 farklı set ekspresyon vektörü kullanıldı. EF-la promotoru taşıyan plazmid ile transfeksiyonu takiben CHO hücreleri normalin iki katı miktarda mutant protein ekspresyonu gösterdi. |3-altbirimin pro- şekilde kaldığı olgun hale çevrilemediği saptandı. Tespit edilebilir Hex B aktivitesi ve P-altbirimin olgun şeklinin olamayışı mutant proteinin bozuk katlandığım ve Endoplazmik Retikulum'da (ER) kaldığım gösterdi. Sonuç olarak, 1) Hex B eksprese eden hücre dizileri oluştururken, HCMV IE pomotoru yerine EF-la promotoru taşıyan vektörlerin kullanımı yüksek |3 protein ekspresyonu elde etmek için daha uygundur. 2) P-altbirimindeki dört aminoasidin (He398-Asn-Lys-Gly401) proteinin katlanmasında önemli rolü vardır. 3) Mutasyon, proteinde kimyasal şaperon ve/veya substrat azaltma tedavilerinin uygulanamayacağı kadar önemli etki yaratmaktadır. Heterodimer yapıdaki proteinlerde mutasyonun her bir altbirimde oluşturduğu etkinin derecesinin bilinmesi yeni tedavi yöntemlerine uygunluğu belirlemede önemlidir.

Özet (Çeviri)

GM2 gangliosidoses are a group of lysosomal storage diseases that result from defects in one of three genes which encode the a, J3-subunits of N-acetyl- P-hexosaminidase (EC 3,2,1,52) A (Hex A) or GM2 activator protein. Because the a and fj-subunits of Hex which is lack in GM2 gangliosidoses, share 60% sequence identities, the Hex A and Hex B genes are believed to have arisen from a common ancestral gene. Thus, a and P-subunits share very similar three dimensional structures with conserved functional domains. In this study, in order to determine the structure-function relationships in Hex and the severity of the mutation for future therapies, we reproduced the 12 bp deletion mutation (1267-1279) in the P-subunit cDNA by in vitro mutagenesis, which is found to be the most frequent mutation in Turkish Tay-Sachs patients and leads to detectable levels of inactive a protein in its pro-form. Promoter evaluation for Hex expression was analyzed at the same time. Three different sets of expression vectors were used, two of which are carrying HCMV IE promoter and one having EF-loc promoter. Following transfection with the plasmid carrying EF-la promoter, CHO cells clearly demonstrated two times higher expression of the mutated protein from the normal, p-subunit was observed in its pro-P form showing that it could not undergo further proccesing to be a mature enzyme. The lack of the detectable Hex B activity and the absence of the mature form of the P-subunit show the mutant protein is misfolded and retained in the ER. As a conclusion, 1) for establishing Hex B cell lines, vectors having EF-la promoter rather than HCMV IE promoter are useful to obtain high expression of P proteins 2) the effect of four aminoacide residues (He398-Asn-Lys-Gly401) in P- subunit is on protein's overall folding 3) this is a severe mutation that is not likely to be treated by the emerging chemical chaperone and/or substrate depletion therapies. Because of the feasibility of new therapeutic approaches, it is important to determine the degree of mutation effects on each subunits of heterodimer proteins.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    339760

    Metakromatik lökodistrofi: Üç arilsülfataz A mutasyonunun (p. 307Glu-Lys, p. 318 Trp-Cys ve c.1165G delesyonu) arilsülfataz A aktivitesi ve arilsülfataz A proteini üzerine etkisinin tanımlanması

    : Characterization of the effect of three arylsulfatase a mutations (p. 307Glu-Lys, p. 318Trp-Cys, c.1165G deletion) on arylsulfatase a activity and arylsulfatase a protein

    ADEM ÖZKAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    BiyokimyaHacettepe Üniversitesi

    Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HATİCE ASUMAN ÖZKARA

  2. Tez No

    848372

    Investigation of the effects of antiinflammatory in the tissues of GM2 gangliosidosis mouse model

    GM2 gangliosidoz fare modelinin dokularında anti-inflamatuar tedavisinin etkisinin araştırılması

    NURSELİN ATEŞ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Moleküler Tıpİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VOLKAN SEYRANTEPE

  3. Tez No

    302377

    Brain lipid profiling of triply mouse model with the deficiencies of sialidase Neu1, Neu4 and ß-Hexosaminidase a enzymes

    Sialidaz Neu1 ve Neu4 ile ß-Hekzosaminidaz a enzim eksikliği olan fare modelinde beyin lipid profilinin çikarilmasi

    ZEHRA KEVSER PEKMEZCİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. VOLKAN SEYRANTEPE

  4. Tez No

    482462

    Investigating the biological role of sialidase NEU4 ve GM3 synthase enzymes in a mouse model of tay-sachs disease

    Sialidaz NEU4 ve GM3 sentaz enzimlerinin tay-sachs fare modellerinde biyolojik rolünün araştırılması

    TALHA BARNAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Genetikİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VOLKAN SEYRANTEPE

  5. Tez No

    492562

    Immunohistochemical, biochemical and imaging-mass spectrometric analysis of brain tissues of mice with combined deficiencies of β-hexosaminidase A, sialidase NEU4 and GM2-AP

    Β-hekzosaminidaz A, sialidaz NEU4 ve GM2-AP birleşik eksikliği bulunan fare beyin dokularının immünohistokimyasal, biyokimyasal ve görüntülü-kütle spektrometrik analizi

    ZEHRA KEVSER TİMUR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyokimyaİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VOLKAN SEYRANTEPE

Geri Dön