Development of a glutathione S-transferase-based biosensor for the detection of heavy metals
Glutatyon S-transferase temelli biyosensör geliştirilmesi
- Tez No: 167434
- Danışmanlar: PROF.DR. MESUDE İŞCAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: GST-(His)6, Biyosensör, Ağır metaller, Dönüşümlü Voltametry, Kapasitans ölçümleri. vn, GST-(His)6, Biosensor, Heavy metals, Cyclic voltammetry, Capacitance measurements
- Yıl: 2005
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 187
Özet
oz AĞIR METAL TAYİNİ İÇİN GLUTATYON S-TRANSFERASE TEMELLİ BİYOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ SAATÇİ, Ebru Doktora, Biyokimya Bölümü Tez Danışmanı: Prof. Dr. Mesude İŞCAN Ağustos 2005, 164 sayfa Çevre kirliliği insan sağlığım etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Özellikle son yıllarda, teknolojinin gelişmiyle birlikte endüstriyel atıklar, pestisitler ve ağır metaller yaşadığımız hayata dahil olmuşlardır. Bütün bu toksik atıklar, içtiğimiz sularda, aldığımız besinlerde birikmektedir ve insan sağlığım ciddi ölçülerde tehdit etmektedir. Bu yüzden, bu toksik maddelerin her türlü çevresel örneklerde yol açtığı kirliliği hassas olarak ölçmek günümüzde oldukça önem kazanmakta ve yöntemler geHştirilmektedir. Bu çalışmada, E.coli BL21(DE3) ekspresyon sistemi içinde, glutatyon-S- transferaz rekombinant proteini elde edilerek, çok düşük konsantrasyonlardaki ağır metallerin tayininde kullanılmak üzere, protein kaynaklı bir biyosensör yapımı tamamlanmıştır. Rekombinant GST proteini E.coli BL21(DE3) ekspresyon sistemi içinde eksprese edilerek, Glutatyon Sepharose 4B afinite kolonu ve Ni- NTA spin kit kullanılarak saflaştınlmıştır. Proteinin ekspresyonu SDS-PAGE ve Western blot analizleri ile tesbit edildi. Rekombinant GST'nin aktivitesi ve kinetik vıözellikleri, substratı l-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) kullanılarak belirlenmiştir. Ürün oluşumu, 0.05 M ve pH'sı 6.9 fosfat tamponunda izlendi. Ortamdaki CDNB, GSH ve protein miktarı sırasıyla, 1 mM, 1.5 mM ve 1.7 [ig'a kadar, 25°C'de doğrusal olarak arttı. GST enzimi'nin, substratı olan CDNB ve kofaktörü GSH için Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burke grafiğiyle hesaplandı. CDNB için Vmax; 5.34 [imol/dk/mg, Km; 0.23 mM, olarak hesaplandı. GSH için Vmax; 6.63 [xmol/dk/mg, Km; 0.27 mM olarak hesaplandı. Biyosensör, rekombinant protein, l-(3-dimetüaminopropil)-3-etil- karbodnmide (EDC) açilleme reaksiyonu ile altın elektrot üzerine kovalent olarak bağlandı. Elektrodun hazırlanması dönüşümlü voltametri ölçümleri ile takip edildi. Biyosensör çalışma elektrodu, dörtlü elektrot sisteminde ölçümü yapan elektrot olarak kullanıldı. Metal iyonunun rekombinant proteine bağlanmasıyla meydana gelen konformasyonel değişiklik sonucunda ortaya çıkan ve metal iyonlarının konsantrasyonu ile doğru orantılı olan kapasitans değişiklikleri ölçüldü. Çalışma elektrodu, standart ağır metal solüsyonları (Cu2+, Zn2+, Cd2+, Hg2+) ile satandardize edilerek kalibrasyonu yapıldı. Biyosensörün çahşma tamponu, pH'sı 8.6 olan 0.1 M Tris-tricine tamponu olarak optimize edildi. GST-(His)6 biyosensörünün ölçüm aralığı, 10 mM ile 1 fM arasında tesbit edildi ve kullanım ömrü yaklaşık iki hafta olarak bulundu. Biyosensörün sensitivitesi Cu2+ için, 100 nM-1 fM; Zn2+ için 10 u.M-1 fM; Cd2+ için, 10 uM-1 fM ve Hg2+ için 10 mM-1 fM olarak bulundu.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT DEVELOPMENT OF A GLUTATHIONE S-TRANSFERASE-BASED BIOSENSOR FOR THE DETECTION OF HEAVY METALS SAATÇİ, Ebru PhD., Department of Biochemistry Supervisor: Prof. Dr. Mesude İŞCAN August 2005, 164 pages In the recent years, environmental pollution becomes a health threatening issue for human beings. Technological developments introduce industrial wastes and heavy metals, and developments in agriculture introduce pesticides into the world that we live. All these toxic wastes accumulate in drinking water and food consumed by humans. Therefore, detection of toxic wastes in all kinds of environmental samples, and development of new detection techniques become an important issue. In this study, a glutathione S-transferase (GST-(His)e) -based biosensor for detection of heavy metals in environmental samples was developed. Recombinant GST-(His)e was expressed in E.Coli BL21 (DE3) expression system and purified with Glutathione Sepharose 4B affinity column and Ni-NTA spin kit. The protein expression was tested by SDS-PAGE and Western blot analysis. GST activities were determined using the GST substrate l-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). Product formation increased up linearly to 1 mM CDNB, 1.5 mM GSH, 1.7 \ig proteins in 0.05 M, pH 6.9 phosphate buffer in the final volume of 1.0 ml at 25°C. IVThe Vmax and Km values for GST-(His)6 towards CDNB and GSH were calculated with Lineweaver-Burk as CDNB Vmax; 5.34 umol/min/mg, Km; 0.23 mM, and as GSH Vmax; 6.63 [Amol/min/mg, Km; 0.27 mM, respectively. The biosensor working electrode was prepared by immobilizing the GST- (His)e by l-(3-dimemylammopropyl)-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride (EDC) coupling on the gold surface. The electrode preparation was confirmed by cyclic voltammetry measurements. The biosensor was inserted as the working electrode in the constructed four-electrode flow cell. The conformational change was determined resulting from the binding of the metal ions to the recombinant protein causing a capacitance change proportional to the concentration of the metal ions. The working electrode is standardized and calibrated by using the standard heavy metal solutions (Cu2+, Zn2+, Cd2+, Hg2+). The buffer system of the biosensor is optimized as 0.1 M Tris-tricine buffer at pH 8.6. The GST-(His)6 biosensor has a large operational range between 1 fM and 10 mM and a storage stability of approximately 2 weeks. The sensitivity range of the biosensor is 100 nM-1 fM for Cu2+; 10 u.M-1 fM for Zn2+; 10 uM-1 fM for Cd2+; 10 mM-1 fM for Hg2+.
Benzer Tezler
- Borik asitin laktoz ile birlikte Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae)'nın bazı biyolojik ve biyokimyasal parametrelerine etkisi
Effects of boric acid in combination with lactose on some biological and biochemical parameters of Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae)
VELİ ŞAHİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyolojiZonguldak Karaelmas ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ENDER BÜYÜKGÜZEL
- Yapı-temelli ilaç tasarım yöntemleriyle glutatyon S-transferaz P1 spesifik özgün inhibitörlerin geliştirilmesi ve kinetik çalışmaları
Development of novel glutathione S-transferase specific inhibitors BY structure-based drug design methods and kinetic analysis
DENİZ CEYHAN
Doktora
Türkçe
2015
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YASEMİN AKSOY
PROF. DR. BURAK ERMAN
- Katarakt oluşumu ile detonsifikasyon enzimlerinden glutatyon S-Transferaz (GST) enzimi polimorfizmi ve DNA tamir enzimlerinden XPD enzimi polimorfizmi arasındaki ilişkinin incelenmesi
Evaluation of possible relationship between cataract formation and GST enzyme polymorphism, a member of antioxidant system, and XPD enzyme polymorphism, a DNA repair enzyme
MUSTAFA ÜNAL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2001
Göz Hastalıklarıİstanbul ÜniversitesiGöz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. KEMAL DİKİCİ
PROF.DR. KAZIM DEVRANOĞLU
- Bazı Orthrias (Çöpçü balığı) türlerinin biyoinformatik ve deneysel karakterizyonu
Some Orthrias (Scavenger fish) species experimental and bioinformatics characterization
CEM ÖZİÇ
- Nikel oksit ve nikel oksit nanopartiküllerinin rat beyin dokusuna etkileri
Effects of nickel oxide and nickel oxide nanoparticles on rat brain tissue
IBRAHIM WAZIR ANWAR