Candida türlerinin restriksiyon enzim analizi ile identifikasyonu
Identification of candida species by restriction enzyme analysis
- Tez No: 195568
- Danışmanlar: PROF.DR. MİNE YÜCESOY
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Candida türleri, identifikasyon, restriksiyon enzim analizi, Candida species, identification, restriction enzyme analysis
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 113
Özet
İmmun baskılanmış hastalarda en sık rastlanan ve en önemli fungal patojenler mayalar olup; bunlar arasında da en sık Candida türlerinin izlendiği bildirilmektedir. Klinik örneklerden soyutlanan Candida türünün belirlenmesi, antifungal ilaçlara duyarlılık hakkında bilgi verdiği gibi ampirik sağaltım seçimine de ışık tutabilmektedir. Bu nedenle soyutlanan suşların hızlı, güvenilir ve doğru identifikasyonu büyük önem taşımaktadır. Çalışmamız, ciddi klinik tablolardan soyutlanan ve klasik yöntemler ile tanımlanmış olan Candida albicans ve non-albicans Candida türlerinin daha hızlı ve güvenilir identifikasyonu amacıyla restriksiyon enzim analizi yönteminin uygulanması ve sonuçların karşılaştırılması amacıyla planlanmıştır. Araştırmamıza Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Mikoloji laboratuvarına gönderilen sistemik örneklerden soyutlanan toplam 146 Candida suşu (40 C. albicans, 27 C. parapsilosis, 26 C. tropicalis, 25 C. glabrata, 11 C. kefyr, 10 C. krusei, 7 C. guilliermondii) ile birlikte C. albicans ATCC 14053, C. parapsilosis ATCC 90018 ve C. krusei ATCC 6258 numaralı kalite kontrol suşları dahil edilmiştir. Çalışmaya alınan tüm Candida suşları %50 gliserol içeren beyin kalp infüzyon buyyonunda -80°C'de stoklanmıştır. Sabouraud dekstoz agar'a iki kez pasajlanan suşlar 37°C'de 24- 48 saat inkübe edilmiştir. Üreyen suşlar çimlenme borusu testi, mısır unu tween 80 agar, CHROMagar Candida (CHROMagar, Fransa) besiyerlerindeki morfolojik özellikleri ve API 20C AUX (Biomérieux, Fransa) otomatik identifikasyon işlemi sonucuna göre tanımlanmıştır. Tüm Candida suşlarının DNA eldesi ?Nucleospin Tissue Kit? (Macherey-Nagel, Almanya) ile EDTA, litikaz ve sorbitol tampon kullanılarak üretici firma önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Daha sonra uygulanan polimeraz zincir tepkimesi için ITS1, 5.8S rDNA ve ITS2 bölgelerini hedef alan öncül1 ve öncül3 kullanılmıştır. Amplifikasyon ürünleri ?GeneMark PCR Clean-Up Kit? kullanılarak saflaştırılmış ve takiben MwoI enzimi ile restriksiyon enzim analizi uygulanmıştır. İncelenen C. albicans suşlarının 36 tanesinde 141, 184 ve 261 bç `lik üç adet bant saptanırken, dört suşun 184 bç, 141 bç ve yaklaşık 165 bç, 95 bç'lik dört adet bant oluşturduğu gözlenmiştir. Çalışmaya alınan C. parapsilosis ve C. tropicalis suşları aynı enzim ile kesim sonucunda sırasıyla 336, 146, 88 bç'lik ve 325, 154, 97 bç'lik üçer adet bant oluşturmuştur. Bu iki türün birbirinden ayırt edilebilmesi için ek olarak BslI enzimi ile de kesim yapılmış ve C. parapsilosis suşları 413, 94, 63 bç'lik üç bant oluştururken, C. tropicalis suşları için 326, 187 ve 63 bç'lik bantlar izlenmiştir. Araştırmamıza alınan C. glabrata suşları MwoI enzimi ile kesim sonucunda 414, 174, 171, 86, 80 bç'lik bantlar oluştururken, C. kefyr suşları için 370, 430 bç'lik iki adet bant ve C. krusei suşları için 289, 134, 83, 54 bç'lik dört adet bant elde edilmiştir. MwoI enzimi ile kesilen yedi adet C. guilliermondii suşunun beş tanesi 355 ve 302 bç'lik, kalan iki suş ise yaklaşık olarak 390 ve 300 bç'lik iki adet bant oluşturmuş; BslI enziminin kullanılmasıyla söz konusu iki suşun diğer beş suştan tamamen farklı bir kesim paterni gösterdiği saptanmıştır. C. albicans suşlarında MwoI enzimi ile uygulanan yöntemin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değerleri sırasıyla %90, %100, %100, %96,4 olarak elde edilmiştir. Aynı yöntemin C. parapsilosis ve C. tropicalis türleri için bu değerler sırasıyla %100, %78,2- 81,5, %49,1- 50,9, %100 olarak saptanmış; BslI enziminin kullanılmasıyla ise tüm değerler %100'e yükselmiştir. C. glabrata, C. kefyr, C. krusei ve C. guilliermondii türleri için MwoI enziminin kullanıldığı restriksiyon enzim analizi duyarlılıkları %100 iken, özgüllükleri %98,6- 100, pozitif prediktif değerleri %71,4- 100 ve negatif prediktif değerleri %100 olarak saptanmıştır. Çalışmada yer alan C. albicans suşlarından MwoI enzimi ile diğerleriyle farklı bölgelerden kesilerek dört bant oluşturan dört ve aynı bölgelerden kesilerek üç bant oluşturan iki adet suş ile farklı ve aynı bölgelerden kesilen ikişer adet C. guilliermondii suşuna çift yönlü dizi analizi uygulanmış ve sonuçlar Bio-Edit version 7.0 programı ile değerlendirilmiştir. Dizi analizi sonuçları incelendiğinde, MwoI enzimi ile farklı kesim paterni gösteren C. albicans suşlarının üçünde adenin yerine guanin nükleotidinin geldiği nokta mutasyonu, bir tanesinde de insersiyon/delesyon tipi mutasyon saptanmıştır. Bu mutasyonlar sonucunda suşlarda MwoI enziminin kesim bölgesine uyan nükleotid dizilimi meydana geldiği ve böylelikle kesim sonucunda diğer suşlardan farklı olarak dört adet bant oluştuğu gözlenmiştir. C. guilliermondii suşlarına ait dizi analizi sonuçları değerlendirildiğinde, her iki enzimle de diğer suşlardan farklı bölgelerden kesilen iki adet suşun Gen bankasında DNA dizisi verilen C. guilliermondii var guilliermondii dizilerine göre (% 66,6) C. guilliermondii var membranaefaciens suşlarına gerek nükleotid dizilimi ( % 91,2) gerekse aminoasit dizilimi açısından çok daha fazla benzerlik gösterdiği belirlenmiş ve bu suşlar C. guilliermondii var membranaefaciens olarak kabul edilmiştir. Araştırmamızda, Candida türlerinin identifikasyonu için altın standart olarak kabul edilen klasik yöntemlerle tanımlamada sorun yaşanan Candida türlerinin identifikasyonunda veya hızlı tanımlama gerektiğinde MwoI ve BslI enzimleri ile uygulanan restriksiyon enzim analizinin kullanabileceği, ancak bu yöntemde de bazı farklılıkların izlenebileceğinin göz önünde bulundurulması gerektiği sonucuna varıldı.
Özet (Çeviri)
Yeasts are the most common and important pathogens in immunosupressive patients and it has been reported that Candida spp. are the most commonly isolated ones among them. Identification of Candida species isolated from clinical specimens gives information about the antifungal susceptibility as well as sheds light to the choice of ampirical treatment. Because of this reason, rapid, reliable and accurate identification of the isolates is very important. This study was planned to apply restriction enzyme analysis for more rapid and reliable identification of Candida albicans and non Candida albicans species isolated from serious clinical cases which had been previously identified by conventional methods and to compare the results. In this study one hundred and fortysix Candida strains (40 C. albicans, 27 C. parapsilosis, 26 C. tropicalis, 25 C. glabrata, 11 C. kefyr, 10 C. krusei, and 7 C. guilliermondii) isolated from systemical specimens at Dokuz Eylul University Hospital Mycology Laboratory and C. albicans ATCC 14053, C. parapsilosis ATCC 90018 and C. krusei ATCC 6258 were included. All Candida isolates were kept at -80°C in 50% glycerol and brain heart infusion broth as stock cultures. The strains which were subcultured onto Sabouraud dextrose agar were incubated at 37°C for 24- 48 hours. The strains were identified according to germ tube test, morphology at cornmeal tween 80 agar and CHROMagar Candida (CHROMagar, France) and API 20C AUX (Biomérieux, France) automatized system. DNA extraction of all Candida species was performed with ?Nucleospin Tissue Kit? (Macherey-Nagel, Germany) using EDTA, lyticase and sorbitol buffer according to the manufacturer?s recommendations. For the polymerase chain reaction, primer1 and primer3 which targeted ITS1, 5.8S rDNA and ITS2 regions were used. The amplification products were purified with ?GeneMark PCR Clean-Up Kit? and following this restriction enzyme analysis was performed with MwoI enzyme. Thirty six of the C. albicans strains produced a restriction enzyme analysis pattern with three 141, 184 and 261 bp bands while four of them produced four 184 bp, 141 bp and approximately 165 bp and 95 bp bands. The restriction of C. parapsilosis and C. tropicalis strains with the same enzyme resulted in three 336, 146, 88 bp and 325, 154, 97 bp fragments, respectively. In order to distinguish these two species, further restriction was performed with BslI enzyme and the lengths of restriction enzyme analysis products were 413, 94 and 63 bp for C. parapsilosis, and 326, 187 and 63 bp for C. tropicalis. Restriction of C. glabrata isolates with MwoI enzyme resulted in five bands of 414, 174, 171, 86, 80 bp. Calculated lengths of 5 restriction enzyme analysis products were 370 and 430 for C. kefyr; 289, 134, 83 and 54 bp for C. krusei isolates. Restriction of five C. guilliermondii isolates with MwoI enzyme showed two bands at 355 and 302 bp while the remaining two strains showed a restriction enzyme analysis pattern with two bands at 390 and 300 bp. Additional digestion with BslI enzyme established that these two strains showed totally different restriction patterns from the other five strains. The sensitivity, specifity, positive and negative predictive values of restriction enzyme analysis performed by MwoI enzyme for C. albicans strains were 90%, 100%, 100%, %96,4, respectively. These values were detected as 100%, 78,2%-81,5%, 49,1%-50,9%, 100% respectively for C. parapsilosis and C. tropicalis isolates. When BslI enzyme was used for restriction, all values for these two species increased to 100%. The sensitivity, specifity, positive and negative predictive values of MwoI enzyme restriction for C. glabrata, C. kefyr, C. krusei and C. guilliermondii strains were found to be 100%, 98,6%- 100%, 71,4%- 100%, 100%, respectively. Sequence analysis of both strands of four C. albicans isolates which resulted in different restriction patterns and two C. albicans isolates which produced three bands with the same enzyme and two C. guilliermondii isolates showing a different restriction enzyme analysis pattern were performed. The evaluation of the sequence analysis results was done by Bio-Edit version 7.0 programme. Three C. albicans isolates which produced a different restriction pattern had point mutations (guanine instead of adenine); one isolate had insertion/deletion type mutation and these mutations were the reason of a different pattern. In addition, sequence analysis of two C. guilliermondii isolates showing various fragments with different lengths by two enzymes were 66.6% similar with GenBank C. guilliermondii var guilliermondii and 91.2% similar with C. guilliermondii var membranaefaciens (nucleotide seqeunce). Because of this high nucleotide sequence similarity, these isolates were accepted as C. guilliermondii var membranaefaciens. As a result, we can conclude that restriction enzyme analysis with MwoI and BslI enzymes can be used for the identification of Candida species which need rapid identification or which are problematic with conventional methods that are still accepted as gold standard although some variations can be observed with this method.
Benzer Tezler
- Klinik örneklerden izole edilen candida'ların karakterizasyonu ve antifungal duyarlılıkları
Characterization and antifungal susceptibilities of candida species isolated from clinical samples
MİNE AYDIN KURÇ
- Rubus idaeus L. (ahududu) ve Punica granatum L. (nar) meyvelerinden izole edilen maya türlerinin moleküler düzeyde tanımlanması ve hücre dışı enzim aktivitelerinin belirlenmesi
Molecular identification of yeast species that isolated from Punica granatum L. (pomegranate) and Rubus idaeus L. (raspberry) and determination of extracell ular enzyme activities
MELİH GÜNAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. TÜLAY TURGUT GENÇ
- Farklı klinik örneklerden izole edilen Candida parapsilosis kompleks türlerinin genotipik olarak tanımlanması
Genotypic identification of the Candida parapsilosis complex species isolated from different clinical samples
ÖZLEM KARATAŞ
- Klinik örneklerden izole edilen candida suşlarının PCR-RFLP yöntemiyle identifikasyonu
Identification of candida strains isolated from clinical samples by using PCR-RFLP method
HAMDULLAH SUPHİ BAYRAKTAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
MikrobiyolojiMustafa Kemal ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NİZAMİ DURAN
- Candida türlerinin tiplendirilmesinde ve antifungal duyarlılığın belirlenmesinde çeşitli yöntemlerin karşılaştırılması
The Comparison of different methods in identification and antifungal susceptibility of candida species
ASUMAN BİRİNCİ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1999
MikrobiyolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. AHMET SANİÇ