Bioprocess development for therapeutical protein production
Terapötik protein üretimi için biyoproses geliştirilmesi
- Tez No: 238271
- Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. STEPHEN G. OLİVER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2008
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Bölümü
- Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu çalışmada, terapatik proteinlerden glikoprotein yapısındaki eritropoietin (EPO) hormonu üretimi için, endüstride kullanılan memeli hayvan hücreleri yerine, rekombinant Pichia pastoris mayası geliştirilmesi ve geliştirilen mikroorganizma kullanılarak bir biyoproses tasarlanması, ayrıca stokiyometrik ve kinetik modellerinin kurulması amaçlanmıştır.İnsan EPO hormonun üretim ortamından saflaştırılmasını sağlayan 6xhistidin dizinini ve saflaştırılmış hormonun 6xhistidin dizininden ayrılmasını sağlayan faktör-Xa proteaz enziminin tanıdığı amino asit dizinini kodlayan DNA, EPO genine entegre edilmiş ve oluşturulan pPICZ?A::epo, P. pastoris kromozomunun AOX1 bölgesine entegre edilmiştir. Doğru klonlar tespit edildikten sonra, üretim kapasitesi en yüksek olan koloni seçilmiştir. Üretilen rHuEPO'nun MALDI-ToF MS ve Western blot teknikleri kullanılarak yapısal analizi gerçekleştirilmiştir. Afinite saflaştırma, deglikozilleme ve faktör-Xa proteaz ile kesme işlemlerinden sonra, 18 kDa büyüklüğündeki EPO öz polipeptidi, P. pastoris hücresinden ilk kez elde edilmiştir.Sonraki aşamalarda, ortam bileşenlerinin ve pH'ın rHuEPO üretimi ve hücre çoğalması üzerine etkileri laboratuvar ölçekli biyoreaktörlerde incelenmiştir. P. pastoris ile yarı-kesikli biyoreaktörlerde, ikincil karbon kaynağı olarak sorbitolün ortama eklenmesinin üretimi arttırdığı bulunmuştur. Ayrıca, P. pastoris fermentasyon prosesleri için ucuz bir karbon kaynağı olarak, biyodizel endüstrisinin yan ürünü olan ham gliserolün kullanılması, ilk kez bu çalışmada önerilmiştir. Karbon kaynağı besleme stratejisi, yarı kesikli biyoreaktörlerde incelenmiş, t= 24 st'te 70 g L-1 kuru hücre ve 130 mg L-1 rHuEPO üretilmiştir.M=102 metabolit ve n=141 reaksiyondan oluşan stokiyometrik model kullanılarak gerçekleştirilen metabolik akı analizi, P. pastoris'in metabolizmasında metanol ve metanol+sorbitolün tepkime ağına etkisini aydınlatmıştır. P. pastoris ile rekombinant protein üretiminin ilk kez oluşturulan, rHuEPO üretim kinetiğini alkol oksidaz ve proteaz üretimleri ile bağdaştıran yapısal kinetik modeli, hücre çoğalması, substrat tüketimi ve r-protein üretimini doğru olarak saptamıştır.
Özet (Çeviri)
In this study, it was aimed to develop a bioprocess using the Pichia pastoris expression system as an alternative to the mammalian system used in industry, for production of the therapeutically important glycoprotein, erythropoietin, and to form stoichiometric and kinetic models.Firstly, the human EPO gene, fused with a polyhistidine-tag and factor-Xa protease target site, in which cleavage produces the native termini of EPO, was integrated to AOX1 locus of P. pastoris. The Mut+ strain having the highest rHuEPO production capacity was selected. The glycosylation profile of rHuEPO was characterized by MALDI-ToF MS and Western blotting. The native polypeptide form of human EPO was obtained for the first time in P. pastoris expression system, after affinity-purification, deglycosylation and factor-Xa protease digestion.Thereafter, effects of medium components and pH on rHuEPO production and cell growth were investigated in laboratory-scale bioreactors. Sorbitol was shown to increase production efficiency when added as a co-substrate. Moreover, a cheap alternative nutrient, the byproduct of biodiesel industry, crude-glycerol, was suggested for the first time for P. pastoris fermentations. Furthermore, methanol feeding strategy was investigated in fed-batch pilot-scale bioreactors, producing 70 g L-1 biomass and 130 mg L-1 rHuEPO at t=24h.Moreover, metabolic flux analysis by using the stoichiometric model formed, which consisted of m=102 metabolites and n=141 reactions, proved useful in further understanding the P. pastoris metabolism. Finally, the first structured kinetic model formed for r-protein production with P. pastoris successfully predicted cell growth, substrate consumption and r-product production rates, where rHuEPO production kinetics was associated with AOX production and proteolytic degradation.
Benzer Tezler
- Konut mekanlarında yoğunluk-kalabalık ilişkisinin belirlenmesinde kullanılabilecek bir yöntem
A Method for determining the relationship between crowding and density in residential spaces
ORHAN HACIHASANOĞLU
- Kuvvetli atıkların yukarı akışlı havasız filtrelerde arıtım kinetiği
Kinetics of strong waste treatment by anqerobic upflow filters
M.ATALAY TİMUR
- Yüksek konsantrasyonda amonyak içeren atık suların döner diskler ile nitrifikasyonu
Nitrification of strong ammonia wastes by rotating discs
H.OKTAR TİMUR
- Polimerik membranlarda kimyasal ve makromoleküler yapının membranın oksijen ve iyonik geçirgenliğine etkileri
The Dependence of the anygen and ionic permeabilities of some polymeric membranes on their chemical and macromolecular structures
H. YILDIRIM ERBİL
- Akışkan yataklı reaktörde biyolojik denitrifikasyon sürecinin incelenmesi
Başlık çevirisi yok
M.GÜRKAN DUMLU
- Elektrofizyolojik ölçümler için düşük gürültülü, mikro-işlemci kontrollu çalışabilen genel amaçlı yükselteç
Başlık çevirisi yok
MEHMET ENGİN
Yüksek Lisans
Türkçe
1987
Elektrik ve Elektronik MühendisliğiMarmara ÜniversitesiYRD. DOÇ. DR. BURHANETTİN CAN