Isolation and characterization of taq DNA polymerase and optimization and validation of newly designed thermal cyclers
Taq DNA polimeraz enziminin izolasyonu ve karakterizasyonu ve yeni tasarlanan pzr cihazlarının optimizasyonu ve validasyonu
- Tez No: 285626
- Danışmanlar: DR. KIVANÇ BİLECEN, PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bölümü
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 141
Özet
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), hedef nükleik asit dizisinin canlı organizma içinde bulunmadan, labaratuvar koşulları altında çoğaltılmasına yarayan moleküler biyolojik yöntemlerin kilometre taşlarından biridir. Yöntem, DNA solüsyonunun, DNA polimeraz enzimi varlığında tekrarlı ısıtılıp-soğutulmasına, sonuç itibariyle de çoğaltılmasına dayanmaktadır. Yüksek sıcaklığa dayanıklı Taq DNA polimeraz enzimi ile farklı sıcaklık dalgalanmalarını sağlayan thermal cycler cihazı bu işlemin en önemli iki elemanıdır. Bu çalışmada, yüksek verimli Taq DNA polimeraz enzimi üretilmiş ve üretilen bu enzim konvansiyonel ve kapiler olmak üzere iki farklı thermal cycler cihazının optimizasyon çalısmalarında kullanılmıştır.Taq DNA polimeraz geni, Thermus aquaticus DNA çoğaltılarak, Gateway® rekombinasyon klonlama teknolojisi ile klonlanmış ve eksprasyonu sağlanmıştır.Yüksek aktiviteye sahip Taq DNA polimeraz enzimi Escherischia coli bakterisinden izole edilmiş ve aktivitesi farklı kaynaklardan elde edilmiş DNA'ların PZR ile çoğaltılmasıyla gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, labaratuvar koşullarında izole ettiğimiz Taq DNA polimeraz'ın aktivitesiyle ticari muadillerinin aktivitesi çok büyük oranda benzerlik göstermektedir. Elde edilen enzimin ileri tanımlanmasında, endonükleaz ve nicking aktivitelerinin olmadığı gösterilmiştir. Bu bağlamda, üretilen DNA polimeraz enziminin fidelitesi aslına uygunluğu bakımından diğer ticari enzimlerle benzerlik gösterdiği belirlenmiştir.Bu çalışmada, Taq polimeraz enzim üretimiyle birlikte konvensiyonel ve kapiler olmak üzere iki adet yeni thermal cycler cihazının optimizasyon çalışmaları da gerçekleştirilmiştir. Konvensiyonel thermal cycler'in % 95'lik güvenilirlik aralığında değerlendirildiğinde ticari muadilleri kadar verimli olduğu gözlemlenmiştir. Kapiler thermal cycler cihazının ise yetersiz izolasyon koşulları ve kapileri cihaz uyuşmazlığı nedenlerinden dolayı daha az verimli olduğu söylenebilir.
Özet (Çeviri)
Amplification of target DNA in vitro via polymerase chain reaction (PCR) is a widely used scientific technique in molecular biology. This method relies on repeated heating and cooling cycles of the DNA and enzyme mixture, resulting with the enzymatic replication of the DNA. A heat stable Taq DNA polymerase and a thermal cycler that enables repeated heating/cooling cycles are the two key components of the PCR. In this study we have produced a high activity Taq DNA polymerase and used this enzyme to validate and optimize two newly developed thermal cyclers- a conventional and a capillary thermal cycler.Taq DNA polymerase gene was amplified from Thermus aquaticus DNA, was cloned and overexpressed using Gateway® recombination cloning technology.Highly active Taq DNA polymerase enzyme was purified from E.coli and its activity was tested by PCR, using different sources of DNA. Our results showed that the enzyme activity of the produced Taq DNA polymerase was not significantly different from the commercial available Taq DNA polymerase. To further characterize the purified enzyme, endonuclease and nicking activities were also tested to be absent. The fidelity of the purified Taq DNA polymerase was also tested and found to be the same as the commercially available Taq polymerases.In this study, in addition to the production of a Taq polymerase, optimization studies for two new thermal cyclers, a conventional and a capillary, was also carried out. The conventional thermal cycler was found to be as efficient as the commercially available thermal cyclers in the 95% confidence interval. The capillary thermal cycler was tested as a proof of concept and our results showed that it works less efficiently due to the insufficient insulation and capillary tubes being longer than the capillary tube holder.
Benzer Tezler
- Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis
Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EVRİM KAPUCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Elektroforetik markırlarla bazı ayçiçeği genotiplerinin karakterizasyonu üzerine araştırmalar
Researches on the characterization of some sunflower genotypes with electrophoretic markers
MELTEM SESLİ
- Isolation and molecular characterization of extracellular lipase and pectinase producing bacteria from olive oil mills
Zeytinyağı işleyen fabrikalardan ekstraselüler lipaz ve pektinaz üreten bakterilerin izolasyonu ve moleküler karakterizasyonu
ASENA ALTAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
Biyomühendislikİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. ALİ FAZIL YENİDÜNYA
- Tetrahymena thermophila ligaz enzim ailesi üyelerinden birinin moleküler ve biyoteknolojik karakterizasyonu
Molecular and biotechnological characterization one of Tetrahymena thermophila DNA ligase enzyme family gene
NURÇİN KÜÇÜKOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyolojiAnadolu Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Genotypic characterization of extracellular enzyme producing thermophilic bacteria in Balçova geothermal region
Balçova jeotermal bölgesinde ekstrasellüler enzim üreten termofilik bakterilerin genotipik karakterizasyonu
ELİF YAVUZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2003
Biyomühendislikİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ALİ FAZIL YENİDÜNYA