Asetilkolinesteraz enziminin insan eritrositlerinden afinite kromatografisi ile saflaştırılması
Purification of acetylcholinesterase from human erythrocyte by affinity chromotography
- Tez No: 301754
- Danışmanlar: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Kimya, Biochemistry, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Afinite, Asetilkolinesteraz, Kinetik, İnhibisyon
- Yıl: 2012
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 91
Özet
Asetilkolinesteraz (AChE) (E.C.3.1.1.7) beyinin gri cevherinde, sinir hücrelerinde, kasta, akciğer, dalak ve eritrositlerde bulunur. Aynı zamanda sarkoplazmik retikulum, lökosit, trombosit, kemik iliği ve plasentada da mevcuttur. Asetilkolinesteraz kolinerjik sinapsiste nörotransmitter asetilkolini hidroliz eder ve birçok fiziksel olayın düzenlenmesinde önemli rol oynar.Bu çalışmada, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B matriksine tirozin uzantı kolu olarak takıldı. Enzimin inhibitörü olan 9-aminoakridine molekülü tirozine kenetlendirilerek yeni bir afinite jeli hazırlandı ve bu jelden asetilkolinesteraz enzimi insan eritrositlerinden saflaştırıldı. Kan numunelerinde plazma ve lökosit tabakaları santrifüjlenerek ayrıldı. Tüplerin altında kalan eritrosit peleti %0,9 (izotonik) NaCl çözeltisi ile üç defa yıkandı. Her defasında 2500xg'de 15 dakika santrifüj edildi. Elde edilen eritrositler hacimlerinin 3 katı kadar buzlu hemoliz çözeltisi ile hemoliz edildi ve +4 ºC'de 13.000xg'de 60 dakika santrifüj yapıldı. Çökelek kısmı (membranlar) alınarak 5mL 0,1 M (pH: 7,4) Na-fosfat tamponu içinde süspanse edildi ve %1'lik Triton X-100 ile çözündürüldü. Santrifügasyondan sonra (4oC de, 13.000xg'de 60 dk) üst kısımdaki süpernatant alındı. Hazırlanan 5 mL hemolizat afinite kolonuna verildi. Saflaştırma basamakları sonucunda 0,0153 mg AChE, %23,5 verimle 658 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant bulundu (80 kDa). Enzim aktivite ölçümünde pH:7,4'de asetiltiyokolin iyodat substratı kullanıldı. Saflaştırılan AChE 'ın 20oC'de pH:7,4'de KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,372 mM ve 0,065 EÜ/mL.dk olarak belirlendi. Hazırlanan afinite kolonunda bağlanma kapasitesi 2oC'de pH:7,4 ve 0,1 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 0,07 mg/g jel ve ligand olarak kullanılan takrin inhibitörü I50 değeri 4,5.10-5mM olarak belirlendi.
Özet (Çeviri)
u Acetylcholinestrerase (AChE) (E.C.3.1.1.7) is found into gray substance of brain, nerve cells, muscles, lung and eryyhrocytes.Acetylcholinestrerase cholinergic makes neurotransmitter acetycholine hydrolized at synapsis and it has an important role in arranging several physical phenomenons.In this study, Sepharose-4B was joined as an helping arm to matrix a new affinity gel was prepared to join that enzyme inhibutor by 9 aminoacridine and acetylcholinestrerase enzyme of this gel was purifield from the human erythrocytesin blood sample, plasma and leukocyte layer were seperated from each other by centrifuge Erythrocytes pellet remaining down tubes have been washed with %0,9 (isotonic) NaCl solution three times.It has been centrifuged at 2500 xg during 15 minutes in each time. They have been hemolized as more as three times with ice obtaining erythrocytes volumes by hemolysis solution and at + 4ºC, 13.000 xg and 60 minutes, centrifuge has been made.After centrifuge, Up supertanant has been received (at 4 C de, 13.000xg 60 minutes). As picking up sediment part (membranes) into 5mL 0,1 M (pH: 7,4) Na-phosphate buffer has been made dispersible and it has been solubilized by %1?lik Triton X-100.Arranged 5 ml hemolysis has been given to affinity column. At the result of purifying phases,0,0153 mg AchE has been purified with %23,5 efficiency 658 floor.Enzyme purity of purified has been controlled withSDS-PAGE and single band has been found(80 kDa).At enzyme activity measure, acetylcholine iodate substract has been used.Purified AChE at 20ºC, at pH:7,4 Km and Vmax values respectively as 0,372mM and 0,065 EÜ/mL.minutes have been determined. Affinity column arranged column bonding capacity at 2ºC pH:7,4 and 0,1 M ionic intensity concentration as using 0,07 mg/g gel and ligand tacrine inhibitor I50 value as 4,5.10-5mM has been determined.Keyword: Affinity, acetylcholinesterase kinetics, inhibition
Benzer Tezler
- Bazı antibiyotiklerin asetilkolin esteraz ve glutatyon S-transferaz enzim aktiviteleri üzerine in vitro etkilerinin araştırılması
Investigation of the in vitro effects of some antibiotics on acetylcholine esterase and glutathione S-transferase enzyme activities
GURBET ÇELİK
- İnsan beyin asetilkolinesteraz enziminin klonlanması, E. coli'de ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu
Cloning, expression in E. coli, and characterization of human brain acetylcholinesterase
HAMİD CEYLAN
Doktora
Türkçe
2016
BiyolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN
- İnsan plazma ve eritrosit hemolizatı asetilkolinesteraz (AChE, EC.3.1.1.7) enzimi üzerine bazı antibiyotik ve ağrı kesici ilaçların in vitro etkilerinin araştırılması
The investigation of in vitro effects of some antibiotic and painkiller drugs on the asetylcholinesterase (AChE, EC.3.1.1.7) enzyme in hemozylate of human eritrocite and plazma
MEHMET RIZA KIVANÇ
- Testing the toxicity and effectiveness of new treatment options for alzheimer's disease in a zebrafish brain model of amyloid toxicity
Alzheımer hastalığı için yeni tedavi seçeneklerinin toksik etkilerinin ve etkinliklerinin amiloid toksisite zebra balığı beyin modelinde test edilmesi
YUSUF KAAN POYRAZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HATİCE GÜNEŞ ÖZHAN
- Pestisitlerin oluşturduğu oksidatif karaciğer hasarına karşı lupeolün rolü
The role of lupeol against pesticides induced oxidative liver damage
MELİS ÇÖREMEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NİHAL ÖMÜR BULAN