Geri Dön

Recombinant Pyrococcus furiosus extracellular alpha-amylase expression in Pichia pastoris

Pyrococcus furiosus hücre dışı alfa-amilaz enziminin rekombinant Pichia pastoris ile ekspresyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 305088
  2. Yazar: ERDEM BOY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GÜZİDE ÇALIK, PROF. DR. PINAR ÇALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Kimya Mühendisliği, Biotechnology, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2011
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Bölümü
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 155

Özet

Bu çalışmada P. furiosus hücre dışı alfa-amilaz enziminin, P. pastoris ile üretilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, PFA enzimini kodlayan gen, tasarlanan ileri ve geri primerle çoğaltıldıktan sonra pPICZalphaA plasmidine klonlanmıştır. P. pastoris X-33 suşu, pPICZalphaA:PFA plasmidi ile transfekte edildikten sonra erlenmeyer üretim ortamında rPFA enzim aktivetisinin varlığı saptanmış ve rekombinant enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. rPFA'nın optimum 95 Celcius sıcaklık ve pH=4.5-6.5 aralığında metal iyonlarına ihtiyaç duymadan çalıştığı, divalent metal iyonları varlığında inhibe olduğu saptanmıştır. Saccharomyces cerevisiae alfa-faktör salgı sinyalinin enzimin amino ucuna eklenmesine rağmen hücre-dışı enzim aktivitesi düşük hücre-içi enzim aktivitesi yüksek bulunmuştur. En iyi rPFA üreticisi olan suş, hücre-içi enzim aktivitelerinin DNS metodu ile belirlenmesiyle saptanmıştır. Enzim üretimi ve hücre çoğalması üzerine pH etkisi, erlenmeyer deneyleri ile incelenmiş, pH=6 tampon çözeltisinde 4800 U/l alfa-amilaz aktivitesi ve 7.30 g/l yaş hücre derişimi tesbit edilmiştir. Daha yüksek miktarda rPFA üretmek amacıyla pH=4 ve pH=5 pH kontrollü işletim koşullarında, 1 litre çalışma hacminde iki farklı biyoreaktör deneyi tasarlanmıştır. Her iki deneyde de spesifik hücre çoğalma hızını 0.03 h-1 de tutacak şekilde önceden belirlenen üstel metanol besleme stratejisi kullanılmıştır. En yüksek ?-amilaz aktivitesi pH=4 koşulunda, üretim fazının t=27 st'inde, yaş hücre derişimi 209 g/l iken 73,400 U/l olarak belirlenmiştir.

Özet (Çeviri)

In this study, it was aimed to express the P. furiosus extracellular alpha-amylase (PFA) in Pichia pastoris. In this context, PFA coding cDNA frame was cloned into pPICZalphaA expression vector. Then wild type P. pastoris X-33 cells were transfected with pPICZ?A::PFA construct. In shake flask production medium, existence of recombinant PFA activity was tested and biochemical characterization of the recombinant product was done. Optimum working temperature and pH of the rPFA were found to be 95 degree Celcius and within the range of 4.5-6.5, respectively. rPFA is independent to metal ions and inhibition by divalent metal ions was observed. Although Saccharomyces cerevisiae alpha-factor secretion signal was fused to the N terminal of rPFA, the majority of the enzymatic activity remained in the intracellular medium. The best producer strain was selected by measuring alpha-amylase activity in cell extracts by DNS method. Effects of pH on cell growth and recombinant protein production were determined by shake flask experiments and maximum of 4800 U/l rPFA was detected with 7.30 g/l wet cell density in pH=6 buffered medium. In order to achieve higher rPFA production, two bioreactor experiments were designed at two different pH operation conditions, namely pH=4 and pH=5, in a working volume of 1 L. Predetermined exponential methanol feeding strategy was employed in order to fix specific cell growth rate at 0.03 h-1. At pH=4 operation, maximum of 73,400 U/l alpha-amylase activity was detected at the t=27 h of production phase when the wet cell density was 209 g/l.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    457270

    Pyrococcus furiosus kitinazının rekombinant üretimi ve analizi

    Production and analysis of recombinant chitinase from Pyrococcus furiosus

    TUĞBA AKSOY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyomühendislikGaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BİLGE HİLAL ÇADIRCI

  2. Tez No

    305083

    Bioprocess development for thermostable glucose isomerase production

    Isıya dayanıklı glukoz izomeraz üretimi için biyoproses geliştirilmesi

    VAHİDEH ANGARDİ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    BiyokimyaOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Bölümü

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  3. Tez No

    783309

    Expression, purification and characterization of high-fidelity DNA polymerase

    Yüksek-duyarlı DNA polimeraz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    KÜBRA TÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  4. Tez No

    772209

    Recombinant production and characterization of a novel N-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp. infantis 157F

    Recombinant production and characterization of a novel n-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp.infantis 157F

    HATİCE DUMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

  5. Tez No

    794635

    İnsan Kemik Morfogenetik Protein 2'nin (BMP2) rekombinant olarak üretilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin araştırılması

    Recombinant expression, biochemical characterization and biological activities of the Human Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)

    YASİN AYDIN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSA GÖKÇE

Geri Dön