Geri Dön

Metabolical engineering of Pichia pastoris for extracellular thermostable glucose isomerase production

Metabolik mühendislik yaklaşımıyla geliştirilen Pichia pastoris ile hücre dışı termostabil glukoz izomeraz üretimi

PDF İndir

  1. Tez No: 313747
  2. Yazar: ÖZGE ATA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 173

Özet

Bu çalışmada, metabolik mühendisliği yaklaşımıyla aktif termostabil glukoz izomeraz (GI) enzimi üretebilen Pichia pastoris suşunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, araştırma program iki ana alt programda yürütülmüştür. İlk kısımda, Thermus thermophilus'a ait xylA geni çoğaltılmış ve pPICZ?-A expresyon vektörüne yerleştirilmiştir. Elde edilen pPICZ?-A::xylA vektörü daha sonra P. pastoris genomunda bulunan AOX1 lokusuna klonlanmış ve xylA geninin metanolle indüklenen alkol oksidaz promoter vasıtasıyla ekspresyonu sağlanmıştır. Elde edilen rekombinant P. pastoris suşları içinden, spesifik enzim aktivite analizi ve SDS-PAGE yöntemiyle en iyi üreten suş seçilmiş ve eP20 olarak adlandırılmıştır. Daha sonra, farklı tuz ve sorbitol konstantrasyonlarının hücre çoğalması ve rekombinant GI aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Farklı konsantrasyon değerlerinde tuz içeren üretim ortamlarının kullanıldığı deneyin sonucunda maksimum hücre derişimi ve GI aktivite değeri 30 g L-1 sorbitol, 4.35 g L-1 amonyum sülfat, 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 6.0), 14.9 g L-1 MgSO4?7H2O, 1.17 g L-1 CaSO4 ?2H2O, 1 ml L-1 kloramfenikol ve 4.35 ml L-1 PTM1 içeren ortamın optimum olduğu bulunmuştur. Bu deneyde, maksimum hücre konsantrasyonu 6.3 g L-1 ve maksimum rekombinant GI aktivitesi 3.21 U L-1 olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, başlangıç sorbitol konsantrasyonun (CS0) hücre çoğalması ve rekombinant GI aktivitesi üzerine etkisinin araştırıldığı deneyde, maksimum hücre konsantrasyonu ve rekombinant GI aktivitesi CS0=50 g L-1 sorbitol içeren ortamda sırasıyla 7.32 g L-1 ve 3.6 U L-1 olarak elde edilmiştir.Çalışmanın ikinci alt programında, 1 L'lik çalışma hacmine sahip pilot ölçek biyoreaktör deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu bağlamda, fermentasyon süresince hücre çoğalması, rekombinant GI aktivitesi, AOX aktivitesi, toplam proteaz aktivitesi ve ortamda bulunan organik asit derişimi analiz edilmiştir. Ayrıca, spesifik büyüme hızı, verimler ve spesifik tüketim hızları da hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar, pH ve oksijenin kontrol edildiği biyoreaktör üretim koşullarının rekombinant GI aktivitesi üzerinde önemli bir artışa sebep olduğunu göstermiştir. Deney sonucunda, rekombinant GI aktivitesinde 56.1-kat bir artış gözlenmiş ve t=12 `de 202.8 U L-1 aktivite değeri elde edilmiştir. Bununla birlikte maksimum hücre konsantrasyonu 85.2 g L-1 olarak t=36'da elde edilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmayla birlikte, aktif termostabil rekombinant GI enzimi hücredışı olarak ilk kez bir maya hücresinde üretilmiştir.

Özet (Çeviri)

The aim of this study is to develop a metabolically engineered P. pastoris strain for production of an active extracellular thermostable glucose isomerase (GI) enzyme by using genetic engineering techniques. For this purpose, research program was performed in two sub-programs. In the first sub-program, xylA gene from Thermus thermophilus was amplified and inserted into pPICZ?-A expression vector. Thereafter, this pPICZ?-A::xylA vector was cloned into AOX1 locus in P. pastoris genome and expressed under alcohol oxidase promoter which is induced by methanol. After constructing the recombinant P. pastoris strains, the best producing strain was selected according to the specific enzyme activity assay and SDS-PAGE analyses in batch shaker-bioreactor experiments. The selected recombinant P. pastoris clone carrying xylA gene in its genome was named as eP20. Using recombinant P. pastoris eP20 clone, effects of salt and sorbitol concentration on the cell growth and recombinant GI activity were investigated. The data obtained from the experiments showed that the maximum cell and GI activity values were obtained in production medium that contained 30 g L-1 sorbitol, 4.35 g L-1 ammonium sulphate, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0), 14.9 g L-1 MgSO4?7H2O, 1.17 g L-1 CaSO4 ?2H2O, 1 ml L-1 chloramphenicol and 4.35 ml L-1 PTM1; where, the maximum biomass and recombinant GI activity were calculated , respectively, as 6.3 g L-1 and 3.21 U L-1. Moreover, the research program related with the effect of initial sorbitol concentration shows that optimum initial sorbitol concentration, CS0 is 50 g L-1 that resulted a cell concentration and recombinant GI activity which are 7.32 g L-1 and 3.6 U L-1, respectively.In the second part of the M.Sc. of the study, a pilot scale bioreactor experiment in a working volume of 1 L was performed in controlled bioreactor system. The variations in the cell growth, recombinant GI activity, AOX activity, total protease activity and organic acid concentrations throughout the fermentation were analyzed whereas the specific growth rates, yield coefficients and specific consumption rates were also calculated. The results showed that a pH and oxygen controlled operation enabled an important increase in recombinant GI activity. In this context, recombinant GI activity was increased as 56.1-fold and resulted in 202.8 U L-1 at t=12 whereas the maximum biomass concentration was obtained as 85.2 g L-1 at t=36. In this study, an active thermostable recombinant GI enzyme was produced extracellularly by a yeast cell, i.e. recombinant P. pastoris, for the first time.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    570158

    Design and construction of double promoter systems andtheir use in pharmaceutical protein production inP. pastoris

    P. pastoris ikili-promotör sistemleri tasarımı ve oluşturulması ile farmasötik protein üretimine katkısı

    İREM DEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  2. Tez No

    313776

    Recombinant transglutaminase production by metabolically engineered Pichia pastoris

    Metabolik mühendislik teknikleriyle modifiye edilmiş Pichia pastoris kullanarak rekombinant transglutaminaz üretimi

    BURCU GÜNDÜZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. PINAR ÇALIK

    DR. REMZİYE YILMAZ

  3. Tez No

    463601

    Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris

    Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi

    ASLAN MASSAHI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON

  4. Tez No

    489447

    Metabolic engineering with a novel promoter in Pichia pastoris for recombinant human growth hormone production: Effects of oxygen transfer conditions

    Rekombinant insan büyüme hormonu üretimi için yeni bir promotor ile Pichia pastoris'te metabolik mühendislik tasarımları: Oksijen aktarım koşullarının etkisi

    ÖZGE KALENDER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  5. Tez No

    688163

    Effects of metabolic engineering of ethanol utilization pathway in Pichia pastoris on recombinant protein production and transcription levels in central metabolism

    Pichia pastoris'in etanol tüketim yolunda yapılan metabolik mühendisliğinin rekombinant protein üretimi ve merkezi metabolizmadaki transkripsiyon düzeylerine etkisi

    İDİL DAYANKAÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR

Geri Dön