Geri Dön

Molecular characterization of ethanol resistance in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae'de etanol direncinin moleküler karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 315291
  2. Yazar: ARMAN AKŞİT
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 105

Özet

Saccharomyces cerevisiae mayası binlerce yıldan beri insanoğlu tarafından ekmek yapımı, bira yapımı ve şarap yapımı gibi çeşitli amaçlarla kullanılmaktadır. Bir model organizma ve genom dizilenmesi tamamlanan ilk ökaryot olması sebebiyle S. cerevisiae ökaryotik hücre ve moleküler biyolojisi için büyük öneme sahiptir. Şekerleri etanole hızlı ve etkili bir şekilde dönüştürme yeteneği, ve yüksek etanol konsantrasyonlarına (8%, v/v) dayanıklı olması sebebiyle, S. cerevisiae biyoteknolojideki öncü maya ?hücre fabrikası?nı temsil eder ve dünyanın başlıca biyoteknolojik ürünü olan içilebilir ve endüstriyel etanol üretiminde en fazla kullanılan mikroorganizmadır. S. cerevisiae mayası bira, şarap, ekmek üretim endüstrilerindeki kullanımı dışında, son yıllarda biyo-yakıt olarak kullanılan biyo-etanol üretim proseslerindeki kullanımı ile de çok büyük önem arz etmektedir. Fosil yakıtların fiyat artışı ve hızlı tükenmesi biyoetanol üretimi ve biyoetanol üretim mekanizmalarının bu mayada araştırılmasını sağlamıştır. Ayrıca biyo-etanol, fosil yakıtlarla kıyaslandığında, yenilenebilir ve sürdürülebilir ürün olma, hava kirliliğini, sera gazlarını ve CO2'i azaltma gibi daha iyi özelliklerinden dolayı her geçen gün daha fazla önem kazanmaktadır. Yüksek miktarlarda etanol üretmek için yüksek veya çok yüksek yoğunluklu fermentasyon koşulları kullanılmaktadır. Fakat, S. cerevisiae mayası çok yüksek konsantrasyonlarda (14%, v/v) etanole karşı hassastır. Etanol, biyolojik membranlardan difüzyonla serbestçe geçerek hücre büyümesinin inhibisyonuna ve hücre canlılığının azalmasına, ayrıca etanol fermentasyon hızının ve son verimin düşmesine neden olmaktadır. Yüksek konsantrasyonlarda etanolün protein konformasyonunu bozduğu, glukoz, amonyum, maltoz ve amino asitlerin alınımını etkilediği bilinmektedir. Bu nedenlerden dolayı, biyokütleden biyoetanol üretimi için, yüksek konsantrasyonda etanole toleranslı suş eldesi arzu edilmektedir. Bunun için, S. cerevisiae'deki etanol stres tolerans mekanizmalarının anlaşılması oldukça önemlidir ki bu, evrimsel mühendislik gibi çeşitli farklı stratejilerle elde edilmiş özellikleri geliştirilmiş mayalar sayesinde çalışılabilir. Evrimsel mühendislik, tersine metabolizma mühendisliği stratejisinin bir alt dalıdır ve suş geliştirmesinde başarıyla kullanılan, çok güçlü bir yöntemdir. Bu yöntem, genetik özellikler bakımından karışık bir popülasyondaki istenilen fenotipe sahip olan mutantların seçilimine dayanmaktadır.Bu çalışmanın amacı, etanol stres direncinden sorumlu mekanizmalar hakkında; genetik, fizyolojik ve fenotipik unsur ve göstergelerin araştırılması ile daha geniş bilgiler elde etmektir. Önceki bir çalışmada etanole dirençli mutantlar, evrimsel mühendislik yönteminin sabit (%5 etanol, v/v) ve artan (% 5'den %11,4'e) stres uygulamaları kullanılarak elde edilmiştir. Daha sonra, artan stres uygulaması stratejisi ile elde edilen mutant bireyler başka endüstriyel streslere çapraz dirençleri açısından fenotipik olarak karakterize edilmişlerdir. Bu çalışmada, bu mutantlar mikrodizileme analizi ile transkriptomik olarak analiz edilmiştir. Transkriptomik analizlere paralel olarak büyüme eğrileri elde edilmiş; ayrıca glukoz, asetat, etanol ve gliserol gibi hücre dışı metabolitler ile glikojen, trehaloz gibi hücre içi metabolitlerin üretimi araştırılmıştır. Hücre dışı metabolit miktarları, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) analizlerinden elde edilmiş veriler sayesinde değerlendirilmiştir. Stres dirençleri, en muhtemel sayı (MPN) ve damlatma deneyleri ile belirlenmiştir. Bunun haricinde, etanole dirençli mutant kültürlerde mitokondriyal kusur görülme sıklığı araştırılmış ve bu mutant kültürlerin genetik olarak stabil olup olmadıkları incelenmiştir. Evrimsel mühendislik yöntemi ile elde edilen etanol stresine dirençli mutantlardan B2'nin en dirençli mutant olduğu, B8'in ise birden fazla stres etmenine çapraz direnç gösterdiği önceki çalışmalardan bilinmektedir. Hayatta kalma (viability) testinde, sürekli strese maruz kalan hücrelerin stres sonrasında vejatatif olarak büyüyebilme kabiliyetleri incelenmiştir. Bu deney sonucunda beklendiği gibi mutant B2'nin hayatta kalma seviyesi mutant B8 ve yabani tip kültüre göre daha yüksek bulunmuştur. Bu sonuç, önceden elde dilmiş sonuçları doğrulaması açısından oldukça önemlidir. 5-tüp MPN metodu ile, mutant B2 ve B8'in genetik kararlılıkları test edilmiştir. Her bir pasajlama sonrasında stres direnç seviyeleri açısından düzenli bir azalma görülmediği için etanole dirençli mutant B2 ve B8'in genetik olarak kararlı olduğu belirlenmiştir. Petite sıklığı (petite frequency) deneyinde yabani tip, ara popülasyonlar A2 ve A23, son popülasyon A98 ve mutant bireyler B2 ve B8 kullanılmıştır. Solunum yapamayan, büyümek için yalnızca fermentasyonu kullanan hücreler, eser miktarda fermente edilebilir karbon kaynağı varlığında çok az da olsa büyüyebilirler. Bu nedenle küçük (petite) koloniler oluştururlar. Petite sıklığı, petite kolonilerin sayısının toplam kolonilere oranı olarak ifade edilmektedir. Bu deney sonucunda, etanol stresine dirençli mutantlarda neredeyse hiç petite görülmediği; oysaki yabani tipte petite sıklığının çok yüksek miktarda olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuç, etanol stres direnci için sağlam ve fonksiyonel mitokondriye gereksinim olduğunu göstermesi açısından oldukça önemlidir. Herhangi bir stres etmeninin olmadığı kontrol koşulunda elde edilmiş büyüme eğrilerine göre, yabani tip kültür ile mutant kültürler B2 ve B8'in spesifik büyüme hızlarının aynı olduğu görülmüştür. Bu sonuç; başlangıçta rasgele mutasyon geçirmiş olan yabani tip kültürden evrimsel mühendislik stratejisi ile elde edilmiş olan etanole dirençli mutant bireyler B2 ve B8'de, stressiz koşulda büyüme yeteneğinde bir azalma olmadığını göstermesi açısından oldukça önemlidir. Yine stres içermeyen koşulda, trehaloz ve glikojen üretim miktarları incelenmiştir. Etanole dirençli mutantlar B2 ve B8'de yabani tip kültüre kıyasla dikkate değer farklılıklar saptanmıştır. Stressiz koşulda, yabani tip ne trehaloz ne de glikojen üretememiştir. Fakat mutant kültürler, bu karbohidratlardan anlamlı miktarlarda üretmişlerdir. Trehalozun hücre için önemi özellikle stres koruyucu fonksiyonundan ileri gelmektedir. Stres uygulaması olmamasına rağmen mutant kültürlerde yabani tip kültüre kıyasla bu karbohidratlardan önemli miktarlarda üretilmesi, etanole dirençli mutant kültürlerde stressiz koşulda dahi stres koruyucu fonksiyonların oldukça etkin olduğunu göstermektedir. Hücre içi metabolit miktarlarının tayini için öncelikle yabani tip kültür ve mutant B2, hem stres içermeyen hem de %8 (v/v) oranında etanol içeren sıvı besiyerinde eş zamanlı olarak inkübe edilmiştir. Belirli zaman aralıklarında toplanmış örneklerdeki hücre dışı metabolit miktarları ?Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi? (HPLC) yöntemi kullanılarak analiz edilmiş ve büyüme eğrileriyle birlikte değerlendirilmiştir. Beklendiği üzere stres varlığında hem B2'nin hem de yabani tip kültürün spesifik büyüme hızı azalmıştır. Ancak, spesifik büyüme oranındaki azalma yabani tip kültürde çok daha fazla bulunmuştur. Bu nedenle 8% (v/v) etanol stres varlığında etanole dirençli mutant B2'nin daha iyi büyüdüğü anlaşılmaktadır. Bu sonuç, önceden yapılmış olan deneyleri doğrulaması bakımından dikkat çekicidir. Beklendiği gibi hem yabani tip kültürde hem de B2 kültüründe, etanol stresi varlığında glukoz tüketim hızı yavaşlamış ve 48. saat itibariyle glukoz tam olarak tüketilememiştir. Bu sonuca paralel olarak etanol üretim hız ve miktarında da düşüş gözlenmiştir. Stres varlığında da yokluğunda da mutant B2'nin yabani tip kültüre göre daha fazla gliserol ürettiği tespit edilmiştir. Ayrıca etanol stresi varlığında yabani tip kültürde asetat üretiminin düştüğü; halbuki B2'de anlamlı bir artış olduğu belirlenmiştir.Mikrodizileme analizine göre, yabani tipe kıyaslandığında B2 ve B8'de anlatım seviyesi en az iki kat değişen genler sırasıyla 228 ve 396 adettir. Mikrodizileme analizi için kullanılan kültürler stressiz koşulda inkübe edildikleri halde, yabani tip kültüre kıyasla B2 ve B8'in gen anlatımında çok anlamlı bir fark belirlenmiştir. Bu sonuç, stres içermeyen ortamda B2 ve B8'in fizyolojik olarak yabani tip kültürden farklı oluşunu açıklaması açısından oldukça önemlidir. Her iki mutantta da expresyonu en fazla azalan gen, homotalik dönüşüm endonükleazını kodlayan HO geni olarak bulunmuştur. HO geni, mayada eşey tipinin değişim mekanizmasını başlatmaktan sorumludur, bu nedenle haploid hücrelerde anlatımı yapılan bir gendir. Önceden yapılmış olan çalışmalarda mutant B2 ve B8'in diploid hale geçmiş oldukları tespit edilmiştir. Mikrodizileme analizi bu tespiti doğrulamıştır. Ayrıca, her iki mutantta da expresyonu en fazla artan gen, mayoz bölünmeyi uyaran IME4 geni olarak bulunmuştur. Bu genin anlatımı diploid hücrelere özgü olduğundan, mutant kültürlerde bu genin ifadesinin seviyesindeki artış aynı şekilde mutant kültürlerin diploit oluşunu kanıtlamaktadır.Elde edilen bu sonuçlar, evrimsel mühendislik yöntemi ile elde edilmiş mutant kültürlerin, yabani tip kültüre kıyasla fenotipik ve fizyolojik açıdan farklı olduğunu göstermiş, transkriptomik analiz sonucu da bu farklılığı doğrulamıştır

Özet (Çeviri)

Yeast Saccharomyces cerevisiae has been utilized by humankind for thousand of years for several purposes such as baking, brewing and wine production. Because of being a model organism and the first eukaryote to have its genome completely sequenced, Saccharomyces cerevisiae is of great importance for eukaryotic cellular and molecular biology. Because of its very high capability for rapid and efficient conversion of sugars into ethanol, and tolerance to high ethanol concentrations (8%, v/v) S. cerevisiae represents the primary yeast `cell factory? in biotechnology and is the most exploited microorganism known, producing potable and industrial ethanol, which is the world?s premier biotechnological commodity. Due to increasing price and accelerating depletion of fossil fuels attracted widespread attention on bioethanol production because of its better properties such as being renewable and sustainable product, reducing air pollution, greenhouse gas, CO2 for global warming. In high or very high gravity fermentations, it is possible to produce high-titers of ethanol. However, S. cerevisiae is sensitive to very high concentrations of ethanol (14%, v/v). Accumulation of ethanol incide the cell has remarkable adverse effects on cellular growth and viability. So, obtaining high ethanol-tolerant strain is desirable for bioethanol production from biomass. For this reason, understanding the ethanol stress tolerance mechanism in Saccharomyces cerevisiae is crucial, whereby it can be studied on tailored and improved yeasts obtained by numerous different strategies such as evolutionary engineering approach. Evolutionary engineering is a powerful strategy, which has successfully been used for strain improvement. This strategy is based on the selection of the mutants with a desirable phenotype among a genetically diverse population. The aim of this study was to gain more insight into the mechanisms responsible for ethanol stress tolerance by investigating genetic, physiological and phenotypic components and indicators. In a previous study, ethanol resistant mutants were obtained via constant (5%, v/v ethanol) and increasing (5% to 11,4% ,v/v ethanol) stress application strategies of evolutionary engineering method. After that, individual mutants of increasing stress application strategy were characterized phenotypically in terms of their cross-resistance for other industrial stresses. In this study, these mutants were analyzed transcriptomically by microarray analysis. In parallel with transcriptomic analysis, growth curves were graphed and co-evaluated with extracellular metabolite levels regarding glucose, acetate, ethanol, glycerol and intracellular metabolite levels including glycogen and trehalose. Production and consumption of metabolites were estimated by using data obtained from HPLC analysis. These results were consistent with the phenotypical characterization results from solid and liquid media. In this study, compared to wild type, glycogen and trehalose production and consumption were so high in ethanol-resistant mutants under control conditions.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    323823

    Evolutionary engineering and molecular characterization of ethanol-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Etanole dirençli Saccharomyces cerevisiae?nin evrimsel mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu

    BURCU TURANLI YILDIZ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. Z. PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    874312

    Molecular characterization of phenylethanol resistance in Saccharomyces cerevisiae

    Feniletanol direncinin Saccharomyces cerevısıae'de moleküler karakterizasyonu

    CAN HOLYAVKİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    547652

    Inverse metabolic engineering and molecular characterization of resistance to phenolic compounds in Saccharomyces cerevisiae

    Saccharomyces cerevisiae'de fenolik bileşiklere direncin tersine metabolik mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu

    BURCU HACISALİHOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    397999

    Molecular and physiological characterization of a salt-resistant Saccharomyces cerevisiae mutant obtained by evolutionary engineering

    Evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edilmiş tuza dirençli bir Saccharomyces cerevisiae mutantının moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu

    ŞEYMA HANDE TEKARSLAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    PROF. DR. CAROLA HUNTE

  5. Tez No

    692811

    Molecular characterization of silver-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Gümüş stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin moleküler karakterizasyonu

    ERGİ TERZİOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    PROF. DR. CENK SELÇUKİ

Geri Dön