Anti-apoptotic effects of SpeedyRINGO in neurodegeneration
SpeedyRINGO proteininin nörodejenerasyondaki anti-apoptotik etkileri
- Tez No: 322827
- Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Genetik, Biology, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2012
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 98
Özet
Nöronlar terminal olarak farklılaşmalarını tamamlamış, bu nedenle de bölünme özelliklerini kaybetmiş hücrelerdir. Fakat,yapılan son çalışmalar göstermiştir ki nörodejenerasyon durumunda, hücre siklus belirteçlerinde belirgin bir artış olmakta ve bu artış nöronlarda hücre siklusunun normal olmayan bir şekilde aktifleşmesine aktive olmasına sebep olmaktadır. Bu programsız hücre siklus aktivasyonunun birçok nörodejeneratif hastalığın, özellikle de Alzheimer hastalığının en erken belirtilerinden biri olduğu kabul edilmektedir. Alzheimer hastalığında, nöronlar G0 adı verilen dinlenme fazından çıkarak yeniden hücre siklusuna girmekte ve hatta genomlarını replike etmektedirler. Fakat bu proses, nöronlar mitotik mekanizmaya sahip olmadıklarından, başarılı bir şekilde tamamlanamamakta ve dejenerasyona uğrayan nöronlar apoptoza gitmektedirler.Amiloid beta birikimi, oksidatif stres, metabolik değişiklikler gibi bir çok sebep nöronları dejenerasyona sürüklemektedir. Özellikle, Alzheimer hastalığının en önemli işaretlerinden biri olan amiloid beta birikimi, nöronlardaki kalsiyum dengesinin bozulmasına ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artması sonucu bir sistein-proteaz olan kalpain enziminin patolojik olarak aşırı aktive olmasına sebep olmaktadır. Kalpainin aşırı aktivasyonunun ise nöronlarda hücre siklus aktivasyonu ve apoptoza sebep olan en önemli etkenlerden biri olduğu belirtilmektedir.Kalpainin patolojik olarak aktive olması nöronları direkt ya da dolaylı yoldan apoptoza sürüklemektedir. Dolaylı yol, kalpainin p35 adlı proteini p25 ve p10 olarak iki parçaya kesmesidir. Normal şartlarda, p35, CDK5 adı verilen ve nörona spesifik olup mitotik olmayan bir proteinin partneridir ve ikisi CDK5/p35 kompleksini oluşturarak nöronlarda farklılaşma ve göç gibi bir çok farklı görevde yer alırlar. Fakat, kalpainin aşırı aktivasyonu durumunda p35, kalpain tarafından p25 ve p10 parçalarına ayrılır. p25 proteini de, p35 gibi CDK5 ile kompleks oluşturma özelliğine sahiptir. Fakat CDK5/p25 kompleksi, CDK5/p35 kompleksinden lokalizasyon ve fonksiyon bakımından farklılık gösterir. Normal şartlarda, hücre siklus aktivasyonu için gerekli olan kompleks Siklin D-CDK4 kompleksidir ve bu kompleks pRb proteinini fosforlayarak hücreleri G1/S geçişine hazırlar. Kalpain aşırı aktivasyonu durumunda ise, nöronlarda hücre siklus aktivasyonuna sebep olarak pRb proteinini fosforlayan kompleksin siklin D-CDK4 yerine CDK5/p25 kompleksi olduğu gösterilmiştir. Fakat bu hücre siklusuna giriş çabası başarısızlıkla sonuçlanmakta ve nöronlar p53 seviyesinde ve aktivitesindeki bir artış sonucu apoptoza gitmektedirler. Bunlara ek olarak, CDK5/p25 kompleksi p53 proteinini substrat olarak kullanıp doğrudan aktifleştirebilmektedir. Bütün bu veriler, kalsiyum ile aşırı aktive olan kalpainin nöronlarda hücre siklusunun yeniden aktivasyonuna sebep olduğunu, ayrıca p53'ün ekspresyonunda ve aktivasyonunda bir artışa sebep olarak dejenere olan nöronları apoptoza sürüklediğini göstermektedir.İndirekt apoptotik etkisinin yanısıra, kalpain aynı zamanda p53'ü substrat olarak kullanıp direkt olarak indükleyebilmektedir. İndüklenen p53 mitokondriyal apoptotik sinyalleri ve kaspaz-3 aktivasyonunu tetikleyerek sonuçta kaspaz bağımlı apoptoza sebep olmaktadır.Siklinler, hücre siklusunun kontrolünde CDK'leri aktive eden ana elemanlar olmakla birlikte, SpeedyRINGO adı verilen başka bir protein de CDK'leri aktive edebilme özelliğine sahiptir. SpeedyRINGO'nun hücre siklusunun kontrolündeki rolünün yanısıra, bazı mitotik hücrelerde kaspaz-bağımlı apoptozu önlediğine dair çalışmalar da mevcuttur.SpeedyRINGO'nun temel görevi hücre siklusunun belirli noktalarda kontrolü olmakla birlikte, son yapılan çalışmalar bu proteine farklı bir görev yükleyerek, DNA hasarına uğramış mitotik hücrelerde anti-apoptotik olarak etkiye sahip olduğunu söylemektedirler. Bu çalışmalarda, SpeedyRINGO'nun, DNA hasarına uğramış U2OS adı verilen mitotik hücrelerde, p53 proteininin varlığına bağlı bir şekilde apoptozu engellediği, ayrıca UV ışıması gibi bir çok dış ve iç apoptotik faktöre karşı, kaspaz-3 aktivasyonunu engelleyerek, mitotik hücreleri koruduğu gösterilmiştir.Bütün bu verilerden yola çıkılarak, bu çalışmada esas olarak, nöronlarda kalpainin aşırı aktivasyonunun ortaya çıkardığı dejeneratif ve apoptotik etkilerinin, SpeedyRINGO proteinini nöronlarda eksprese ettirerek ortadan kaldırılması amaçlanmıştır.Bu amaçla, iki deney grubu oluşturulmuştur. Deney gruplarının birinde hipokampal nöronlarda kalsiyum iyonoforu ile sadece kalpain aktivasyonu yapılarak kalpainin aşırı aktivasyonunun nöronlarda meydana getireceği olası değişiklikleri gözlemlemek hedeflenmiştir. Diğer deney grubunda ise nöronlar öncelikle elektroporasyon yöntemi kullanılarak SpeedyRINGO ile transfekte edilmiş, ardından kalsiyum iyonoforu ve kalsiyum içeren bir medya yardımıyla hücre içi kalpainin indüklenmesi ve aşırı aktifleşmesi sağlanarak SpeedyRINGO' nun nöronları kalpainin bu aşırı aktivasyonuna karşı koruyup koruyamayacağının araştırılması amaçlanmıştır. Daha sonra, her iki deney grubunda da farklı hücre siklus belirteçlerinin yanısıra CDK5, Siklin D1, p27, CDK2, p53 ve aktif kaspaz-3 mRNA ve protein seviyelerindeki değişimlerin karşılaştırmalı olarak araştırılması amacı ile, SpeedyRINGO' nun dejenerasyona uğrayan nöronlarda anti-apoptotik etki gösterip göstermediğini anlayabilmek için QRT-PCR, floresan boyama ve western blotlama teknikleri uygulandı.Çalışmanın sonuçlarına göre, kalpainin indüklendiği nöronlarda CDK5' in mRNA ve protein seviyelerinde artış görülürken, Siklin D' nin mRNA ve protein seviyelerinde belirgin bir artış bulunamamıştır. Bu sonuç da kalpain indüksiyonunun Siklin D yerine CDK5 üzerinden nöronlarda hücre siklus aktivasyonuna yol açtığını görüşünü desteklemektedir. Ayrıca, kalpain indüksiyonu sonucu nöronlarda p53 ün de indüklendiği ve miktarında artış olduğu ve sonrasında aktif kaspaz-3 seviyesinin de arttığı görülürken, öncelikle SpeedyRINGO' nun eksprese edilip daha sonra kalpainin indüklendiği nöronlarda p53 artışı sabit kalırken, aktif kaspaz-3 artışının engellendiği görülmüştür. p53 proetininin varlığı, SpeedyRINGO proteininin kaspaz-3 aktivasyonunu engellemesi için gerekli olduğundan bu, beklenen bir sonuçtur. Bütün bu bulgulara ek olarak, destekleyici bir diğer bulgu da hem DAPI boyaması hem de TUNEL analizi ile elde edilen ve nöronlardaki apoptoz seviyesini gösteren sonuçlarından gelmektedir. Apoptoz analizleri göstermiştir ki, Kalpainin aşırı aktive edildiği nöronlar erken-apoptotik evrede bulunurken, önce SpeedyRINGO ekspresyonunun sağlandığı ve daha sonra kalpainin aşırı aktivasyonunun uyarıldığı nöronlarda hiç bir apoptotik belirti gözlemlenmemiştir.Sonuç olarak, nöronlarda kalpainin aşırı aktivasyonu sonrası p53 seviyesindeki artışa bağlı olarak ortaya çıkan kaspaz-3 aktivasyonunun SpeedyRINGO proteini tarafından engellenebildiği ve böylece nöronların kalpainin apoptotik etkisinden korunabildiği ilk kez bu çalışma ile gösterilmiştir. Bu çalışma, ileride SpeedyRINGO' nun nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılabilmesi için araştırmacılara yeni bakış açıları kazandırabilme potansiyeline sahiptir.
Özet (Çeviri)
Neurons are known to be terminally differentiated non-mitotic cells. However, recent studies have shown an up-regulation of cell cycle markers causing abnormal re-activation of cell cycle in neurons in case of neurodegeneration. This unprogrammed cell cycle re-entry is indicated to be one of the earliest pathological symptoms of the most of the neurodegenerative diseases, especially that of Alzheimer?s disease. In case of Alzheimer?s disease, neurons have been shown to leave the resting G0 phase and re-enter into cell cycle and even replicate their genomes, but this process cannot be successfully completed and degenerating neurons undergo apoptosis, since they do not have the mitotic machinery.There are a number of pathological conditions causing neurodegeneration such as amyloid beta aggregation, oxidative stress and metabolic alterations. Amyloid beta aggregation, a hallmark of Alzheimer?s disease, causes destabilization of calcium homeostasis, which ends up with the elevation of intracellular calcium levels leading to pathological activation of a calcium-sensitive cysteine-protease, calpain. Calpain over-activity has been shown to be very important in terms of causing cell cycle re-activation and degeneration in neurons.Pathologic activation of calpain force neurons into apoptosis directly or indirectly. Indirect way is that overactivated calpain cleaves p35 protein into p25 and p10 fractions. Under normal conditions, p35 is the partner for CDK5, which is a non-mitotic neuron-specific kinase. They form CDK5/p35 complex that takes place in a number of cellular events in neurons. However, over-activity of calpain in neurons results in cleavage of p35 into p25 and p10 fractions, as p35 is a substrate of calpain. p25 is able to bind to CDK5 to form CDK5/p25 complex. However, this complex differs from CDK5/p35 complex in terms of localization and functions. Normally, Cyclin D-CDK4 complex is necessary for the activation of cell cycle. This complex drives cells through G1/S transition by pRb phosphorylation, but in case of calpain induction in neurons it has been shown that CDK5/p25 complex phosphorylates the pRb protein instead of Cyclin D-CDK4 complex and re-activates cell cycle driving neurons through G1/S transition. However, this abnormal cell cycle re-activation cannot be completed and neurons undergo apoptosis by an increase in p53 level. In addition, CDK5/p25 complex can activate p53 directly, as p53 is one of the substrates of CDK5. All these findings strongly indicate that calcium-mediated over-activation of calpain causes an increase in p53 expression and activation, and ultimately ends up with caspase-dependent apoptosis in degenerating neurons.Direct way of calpain-mediated apoptosis is that p53 is the substrate of calpain itself and thus, calpain over-activation allows increased p53 expression and activation. Induced p53 triggers mitochondrial death signals and caspase-3 activation finally resulting in caspase-mediated apoptosis.Although cyclins are major players that take role in activation of CDKs to regulate progression of the cell cycle, there is a novel regulatory protein, SpeedyRINGO, which can activate CDKs. In addition to its role in regulating the cell cycle, SpeedyRINGO has also been indicated to take role in preventing caspase-dependent apoptosis in mitotic cells.Although main function of SpeedyRINGO is the regulation of cell cycle in mitotic cells, recent studies have also attributed a different role for SpeedyRINGO, such that it has an anti-apoptotic effect in DNA-damaged mitotic cells allowing cell survival. It has been shown that SpeedyRINGO prevents apoptosis in a p53-dependent manner in response to DNA damage in U2OS cells, which is a mitotic human osteosarcoma cell line. SpeedyRINGO was indicated to have strong protective effect in mitotic cells that encountered a number of extrinsic or intrinsic apoptotic factors such as UV irradiation. SpeedyRINGO fulfills this function by inhibiting caspase-3 activation and apoptosis in the presence of the gene regulatory protein p53.Therefore, major aim of this study was to regulate cell cycle reactivation and eliminate the apoptotic effects of pathologic calpain induction by expressing SpeedyRINGO in neurons.For this purpose, hippocampal neurons are electrophoretically transfected with SpeedyRINGO and then, calpain was induced by calcium ionophore. After that, QRT-PCR, immunofluorescence and western blotting analysis were performed to determine the changes in different cell cycle markers and in CDK5, Cyclin D1, p27, CDK2, p53 and active caspase-3 mRNA and protein levels in order to understand whether SpeedyRINGO could protect neurons against caspase-mediated apoptosis in the presence of p53. Results showed that calpain induction caused cell cycle re-activation through CDK5 instead of Cyclin D, since mRNA and protein level of CDK5 increased, while Cyclin D levels did not change. Besides that, calpain induction resulted in p53 up-regulation and subsequent caspase-3 activation, whereas SpeedyRINGO expression prevented activation of caspase-3 in the presence of p53. Furthermore, DAPI staining and TUNEL assays were performed for detection of apoptosis. Apoptotic analysis supported these findings that calpain overactivated neurons were in early apoptotic stage, while SpeedyRINGO expressing calpain overactivated neurons were not apoptotic.In this study, it has been shown for the first time that caspase-3 activation after up-regulation of p53 caused by calpain over-activity is prevented by Speedy/RINGO in degenerating neurons. Therefore, Speedy/RINGO acts as a lifesaver for degenerating neurons by inhibiting caspase-dependent apoptosis.
Benzer Tezler
- Zoledronik asidin kanser kök hücrelerine apoptotik etkileri
The apoptotic effects of zoledronic acid on cancer stem cells
HADI ROUHRAZI
- Ratlarda intestinal iskemi reperfüzyon hasarı modelinde humaninin olası anti-apoptotik ve anti-inflamatuar etkilerinin araştırılması
The evaluation of possible anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of humanin in a rat model of intestinal ischemia/reperfusion injury
SELÇUK ÖZKAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2016
Genel CerrahiBülent Ecevit ÜniversitesiGenel Cerrahi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA CÖMERT
- Hematopoietik kök hücrelere kortikosteroidlerin apoptotik etkileri ve çeşitli sitokinlerle bu etkinin modülasyonu
The apoptotic effects of corticosteroids on hematopoietic stem cells and the modulation of this effect by several cytokines
MUZAFFER BEYZA ÇETİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
Fizyolojiİstanbul ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERAP ERDEM KURUCA
- Bevacizumab'ın antianjiyogenik ve apoptotik etkilerinin meme kanseri hücre hattında araştırılması
Investigation of anti-angiogenic and anti-apoptotic effects of Bevacizumab in breast cancer cell line
EBRU ALP
Doktora
Türkçe
2011
Tıbbi BiyolojiGazi ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİNE SEVDA MENEVŞE
- Nitrik oksid ile indüklenmiş prostat kanser kök hücrelerinde za'in apoptotik etkisinin incelemesi
Investigation of apoptotic effects of za in prostate cancer stem cells induced by nitric oxide
HADI ROUHRAZI