Geri Dön

RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, RNF125-Ring finger ve TRIM25-SPRY domainlerinin yapısal çalışmalarda kullanılmak amacıyla üretilmesi ve NMR ile karakterizasyonu

Production and nmr characterization of RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, RNF125-Ring finger and TRIM25-SPRY for structural studies

PDF İndir

  1. Tez No: 334415
  2. Yazar: GÜL DEMİR
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. EMİNE SONAY ELGİN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biochemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Ubiquitilasyon, RIG-I, RNF125, TRIM25, protein ekspresyonu, İzotopik işaretleme, NMR, Ubiquitylation, RIG-I, RNF, TRIM25, Protein expression, İsotopic labeling, NMR
  7. Yıl: 2013
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 112

Özet

Ubiquitin, ökaryotik organizmaların hemen hemen bütün dokularında bulunan, 76 aminoasit içeren küçük regülatör bir proteindir. Molekül ağırlığı 8,5 kilo Dalton kadardır. Ubiquitilasyon, hedef proteinlere tek veya birden fazla ubiquitin proteininin kovalent olarak ilave edilmesi ile meydana gelen yaygın bir post-translasyonel modifikasyon çeşididir. Ubiquitinin en iyi bilinen fonksiyonu hücre içindeki hedef proteinlere bağlanarak onları degredasyon için proteozoma yönlendirmektir. Bunun yanı sıra, ubiquitylasyonun hücre bölünmesi, immün yanıtı ve embriyonik gelişim gibi sayısız hücresel prosesleri düzenlemede de rol aldığı bilinmektedir. Ubiquitilasyonunun işlevi, hedef proteine kaç tane ubiquitin bağlandığına ve bu ubiquitin zincirlerinin hangi lizin vasıtası ile oluşturulduğuna bağlı olarak çeşitlilik gösterir. Ubiquitin konjugasyonu E1 aktive edici, E2 konjuge edici ve E3 ligaz olarak adlandırılan üç enzim sınıfının aktiviteleri ile gerçekleşir. Ubiquitilasyon ile düzenlenen hedef proteinlerden birisi retinoik asit tarafından indüklenen gen-I (RIG-I) dir. Sitozolik RIG-I reseptörü, sitoplazmada 5' trifosfatlar içeren viral RNA?yı tanır ve bir antiviral sinyal kaskatını başlatır. Böylece interferonlar ve sitokin üretimi ile doğal bağışıklık yanıtı aktive edilir. İnsan RIG-I proteininin ubiquitilasyonunun işlevi, ubiquitilasyonu gerçekleştiren E3 enzimine ve ubiquitilasyonun çeşidine bağlı olarak farklılık gösterir. RIG-I?in CARDs (caspase activation and recruitment domains) olarak isimlendirilen iki domaininin TRIM25 E3 enzimi aracılığıyla ubiquitilasyonu, bu domainlerin aktivasyonuna ve viral savunma sistemindeki bir alt basamak olan MAVSa (mitokondrial antiviral sinyal) yönlendirilmesine neden olur. Böylece antiviral kaskat başlatılmış olur. Buna karşın, RIG-I?in bir diğer E3 enzimi RNF125 aracılıklı ubiquitilasyonu onu degredasyon için proteozoma yönlendirir ve bunun sonucunda RIG-I seviyesi düşer. RIG-I?in ubiquitilasyon ile regülasyonunun anlaşılmasında yapısal çalışmaların rolü büyüktür. NMR ile proteinlerin üç boyutlu yapılarının çalışılmasında, yüksek saflıkta ve miligram miktarlarda izotopik olarak işaretlenmiş protein örnekleri gerekmektedir. Bizde bu çalışmada, NMR ile yapısal çalışmalara zemin hazırlamak amacıyla, insan RIG-I-CARDs domainlerinin ve bu domainlerinin ubiquitilasyonunda işlev yapan E3 enzimlerinden TRIM25-SPRY ve RNF125-N76 ring finger domainlerinin bakteriyel sistemde yüksek miktarlarda üretilmesi, saflaştırılması ve NMR ile yapısal çalışmalar için uygunluklarının karakterize edilmesi üzerine çalışıldı. Bu amaçla, öncelikle RIG-I proteininin CARD1 ve CARD2 domainleri ile, RNF125?in ring finger (N76) domaini kodlayan genlerin bakteriyel ekspresyon plazmitleri içerisine klonlanması gerçekleştirildi. Daha sonra, RIG-I-CARD1, CARD2, RNF125-N76 ve TRIM25-SPRY domainlerinin Escherichia coli(E.coli) içerisinde ekspresyonu, saflaştırılması, doğal konformasyonlarına katlanması üzerine çalışıldı. Son olarak, RIG-I-CARD2?nin 15N-işaretli olarak üretilmesi, NMR ile doğal yapısına katlanıp katlanmadığının ve yapısal çalışmalar için uygunluğunun tespit edilmesi çalışmaları gerçekleştirildi. RIG-I-CARD2?nin 15N-1H HSQC spektrumu, bu domainin kullanılan NMR koşulları altında doğal üç boyutlu konformasyonuna katlanmadığını gösterdi.

Özet (Çeviri)

Ubiquitin is a small, 76 amino acid, regulatory protein found in almost all tissues of eukaryotic organisms. Molecular weight of ubiquitin is about 8.5 kDa. Ubiquitylation is a common post-translational modification that involves the attachment of one or more ubiquitin molecules to target proteins. The most well known function of ubiquitylation is to direct cellular proteins to proteosome for degredation. In addition to that, ubiquitin conjugation regulates numerous cellular processes such as cell division, immune response and embryonic development. The function of ubiquitylation varies depending on the number of ubiquitin molecules attached to one another and the identity of lysine residue connecting them. Ubiquitin conjugation requires activities of three enzyme classes called E1 activating enzymes, E2 conjugating enzymes and E3 ligases. One of the target proteins regulated by ubiquitylation is retinoic acid inducible gene-I(RIG-I). Cytosolic RIG-I receptor recognizes the 5? triphosphate containing viral RNAs and initiates the antiviral signal cascade, so that innate immune response with the production of interferons and cytokines are activated. The function of human RIG-I ubiquitylation is determined by the E3 enzyme that carries out ubiquitylation and the type of ubiquitylation. TRIM25 mediated ubiquitylation of RIG-I caspase activation and recruitment domains (CARDs) results in activation these domains. RIG-I is then directed to interact with the next component, mitochondrial antiviral signal (MAVS), in the viral defence system. This leads to the activation of an antiviral cascade. On the other hand, RNF125 mediated ubiquitylation of RIG-I-CARDs directs it to proteosome for degredation which results in reduction of RIG-I levels and termination of the antiviral signaling. Structural studies play an important role in understanding of regulation of RIG-I ubiquitylation. Protein NMR studies require milligram amounts of isotopically labeled protein samples with high purity. Our goal in this study was to produce various domains of E3 enzymes involved in ubiquitylation of RIG-I, namely RNF125 RİNG FİNGER and TRIM25-SPRY domains as well as the individual CARDs (CARD1 and CARD2) of RIG-I in bacterial system with high yields and purity to use for future structural studies by NMR. For this purpose, first the genes encoding human RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, and RNF125 ring finger (N76) domain were cloned into bacterial expression plasmids. Then, RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, RNF125-N76 and TRIM25-SPRY genes were expressed in Escherichia coli (E.Coli), purified and various renaturation conditions were tested. Finally, 15N isotopic labeling of RIG-I-CARD2 was carried out and NMR spectrum of the 15N- labeled sample was recorded to determine the folding status and suitability of the domain for structural studies. 15N-1H HSQC spectrum of RIG-I-CARD2 showed that under the NMR solution and temperature conditions used for recording the data, the domain does not fold into its native three-dimensional conformation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    318281

    ISG15 aktive edici e1 enzimi Ube1L-uf domaıninin NMR solüsyon yapısının belirlenmesi ve bazı insan ubiquitilasyon E3 enzimleri ve RIG-1-CARDs'ın klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması

    NMR solution structure of ISG15 activating enzyme Ube1L uf-domain and cloning, expression, purification of some ubiquitin E3 enzymes and RIG-I CARDs

    ÇAĞDAŞ DAĞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyokimyaMuğla Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. EMİNE SONAY ELGİN

  2. Tez No

    688078

    The regulatory mechanisms of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human eosinophils

    Matriks metalloproteinaz enzimlerinin ve doku inhibitörlerinin insan eozinofil hücrelerinde regülasyon mekanizmalarının incelenmesi

    ECE OYLUMLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI

  3. Tez No

    770757

    Immunoreceptors modulate eosinophilic functions in viral immunity

    Eozinofillerde viral bağışıklık yanıtının oluşumunda hücre zarına bağlı ve hücre içi reseptörlerin rollerinin araştırılması

    LÜBEYNE DURMUŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI

  4. Tez No

    46086

    Bir robot kolunda konum kontrolü için kullanılan pnömatik servo sisteme ait optimum dizayn parametrelerinin tayini

    The Investigation of optimum design parameters of a pneumatic servo system used for the position control of manipulatör arm

    RECEP YENİTEPE

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1995

    Makine MühendisliğiMarmara Üniversitesi

    Makine Eğitimi Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. OSMAN YAZICIOĞLU

  5. Tez No

    356036

    Pnömatik bir sistemin nonlineer modellenmesi ve model öngörülü kontrolü

    Nonlinear modelling and model predictive control of a pneumatic system

    BARIŞ ÖZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Makine Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. AYHAN KURAL

Geri Dön