The regulatory mechanisms of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human eosinophils
Matriks metalloproteinaz enzimlerinin ve doku inhibitörlerinin insan eozinofil hücrelerinde regülasyon mekanizmalarının incelenmesi
- Tez No: 688078
- Danışmanlar: DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Allerji ve İmmünoloji, Allergy and Immunology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 99
Özet
Bağışıklık sistemi, vücudu enfeksiyonlardan korumak için çeşitli patojenik mikroorganizmalara karşı savaşan hücre, doku, organ, molekül ve çözünür faktörlerden oluşan karmaşık ve dinamik bir mekanizmlar bütünüdür.Patojenlere karşı koruyucu rollerinin yanı sıra, bağışıklık sistemi vücuttaki alerjenik maddeleri ve kanser hücrelerini temizleme yeteneğine sahiptir ve ayrıca dokuların yeniden yapılanması merkezi bir rol oynar.Bağışıklık sistemi, doğal ve edinsel bağışıklık olmak üzere birbiriyle bağlantılı iki ayrı kategoriye ayrılmıştır. Doğal bağışıklık hızlı ancak spesifik olmayan bağışıklık yanıtlarından meydana gelen vücudun ilk savunma mekanizmasıdır. Edinsel bağışıklık ise patojenlere karşı spesifik yanıt verirken daha önce karşılaştığı bir patojenle yeniden karşılaşıldığında daha hızlı yanıt verebilmek için immünolojik bellek mekanizması geliştirebilirler. Doğal bağışıklık sistemi, kompleman proteinler, dendritik hücreler, makrofajlar, NK hücreleri, eozinofiller, bazofiller ve nötrofilleri içeren özel miyeloid ve lenfoid hücrelerden oluşur. Bu hücreler, Patern Tanıma Reseptörler (PRR'ler) aracılığıyla evrimsel olarak korunmuş patojenle ilişkili moleküler paternleri (PAMP'ler) tanıyabilirler. PAMP'lerin tanınması üzerine, PRR'ler doğal bağışıklık yanıtı oluşumunu sağlayan bir dizi işlem sonucunda enflamatuar sitokinler üretir. PRR'lar membrana bağlı ve sitozolik reseptörler olmak üzere iki gruba ayrılır. Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) ve C-tipi lektin reseptörleri (CLR) membrana bağlıyken, NOD benzeri reseptörler (NLR) ve RIG-I benzeri reseptörler (RLR'ler) sitoplazmik PRR'ler olarak kabul edilir. İnsanlarda TLR'lerin tanımlanmış 10 üyesi bulunmaktadır. Bunlar arasında TLR2, mikrobiyal lipoproteinleri ve glikolipitleri tanırken, TLR4 gram-negatif bakterilerin lipopolisakkaritlerini, TLR5 ise bakteriyel flagellini tanır. Hücre içerisinde endozomlarda lokalize olan TLR' ler, virüslerin ve bakterilerin nükleik asitlerini tanır. Bunun yanı sıra, NLR'lerin 22 üyesi bulunmaktadır ve PAMP ya da hasar molekülleri (DAMP'ler) tarafından uyarılır. NLR'ler, proteinin C-terminalinde bulunan ve mirobiyal molekülleri veya hasar moleküllerini tanıyan LRR domeyni, NLR proteinlerinin oligomerizasyonunu sağlayan merkezi bir NACHT domeyni ve sinyal iletiminde görev alan bir N-terminal domeyn olmak üzere 3 ayrı domeyden meydana gelmektedir. Yapılan çalışmalar NLR üyeleri NLRP1, NLRP3, NLRC4 ve NLRP6'nın“inflamazom”olarak bilinen büyük protein komplekslerini oluşturup kaspaz-1 aktivasyonunu düzenleyerek biyolojik olarak inaktif olan IL-1β, IL-18'in aktifleşmesine ve hücre dışına salınımına neden olduğunu göstermiştir. Biyolojik olarak aktif olan IL-1β, IL-18 enflamatuar ve antimikrobiyal yanıtı destekleyered TH1 ve TH17 hücreleri gibi yardımcı T hücrelerini etkinleştirir. NLRP3, N-terminal domeyni PYRIN molekülünden oluşan, en çok çalışılan ve iyi karakterize edilmiş bir NLR üyesi olup NLRP3 tarafından ligand tanınması üzerine inflamazom yapısını oluşması bakteriyel, viral ve fungal enfeksiyonlara karşı bağışıklık yanıtı oluşumu için önemlidir. Bunun yanı sıra, NLRC4'ün N-terminal domeyni CARD molekülünden oluşur ve yapılan çalışmalar bakteriyel patojenlerin tip III sekresyon sistemi (T3SS) veya flagella komponentleri ile enfekte edilmiş makrofajlarda NLRC4 proteinin inflamazom kompleksi yapısına katıldığını göstermiştir. Eozinofiller doğal bağışıklık hücresi olup, kan dolaşımındaki lökositlerin %1-6'sını oluşturur. Kandaki ve bazı dokulardaki eozinfil sayısının, parazitik enfeksiyonlara ve allerjenlere karşı immün yanıt sırasında arttığı bilinmektedir. Eozinofiller, organel olarak eozinofil fonksiyonlarının merkezinde yer alan bol miktarda sekretuar granül içerir. Bu granüller, parazitlere ve hava yolu epitellerine karşı güçlü toksikliği olan major basic protein (MBP), eozinofil katyonik protein (ECP), eozinofil peroksidaz, eozinofilden türeyen nörotoksin (EDN), sitokinler, kemokinler, prostaglandinler ve matriks metaloproteinazları (MMP) içerir. Bu granül içerikleri göz önüne alındığında, eozinofiller, hücre dışı matriksin (ECM) yeniden yapılanmasının dinamik bir süreci olan hava yolunun yeniden yapılanmasını yönlendirme potansiyeline sahiptir. MMP'ler ve MMP'lerin doku inhibitörleri, ECM'in yeniden şekillenmesinde merkezi rollere sahiptir. MMP'ler 26 bilinen üyesi ile aktif bölgesinde çinko olan, kalsiyum bağımlı endopeptidaz ailesidir. ECM ile bazal membran bileşenlerini parçalar ve böylece ECM yapısının bileşimini ve bütünlüğünü düzenlerler. Yapılan birçok çalışma MMP'lerin birçok substratı parçalayabildiğini, yara iyileşmesi, enflamasyon ve kanser metastazı gibi biyolojik ve patolojik süreçlerde önemli rolleri olduğunu göstermiştir. MMP'ler sitokinler ve kemokinler gibi enflamatuar aracıları modüle ederek, iltihaplı dokularda enfeksiyon bölgelerine lökositlerin hareketlerini düzenler ve enflamatuar süreçlere katkıda bulunur. Yapılan çalışmalar MMP'ler, TIMP'ler, hava yolu enflamasyonu arasındaki ilişkiyi göstermekte olup ekstraselüler matriksin yeniden yapılanmasında ve enflamatuar süreçlerde önemli bir rolü olan MMP9'un astım hastalarının akciğer dokularındaki eozinofil hücrelerinde bulunup hava yolu enflamasyonunun gelişmesinde patojenik bir rolü olduğunu göstermektedir. Son çalışmalar ayrıca bağışıklık hücrelerinde MMP-9'un TLR'ler üzerinden regülasyonunu göstermiştir. NLR'ler (NLRP3 ve NLRC4) ve inflamazomlar diğer alanlarda akyuvar hücrelerinde çok çalışılmış olsalar da eozinofillerdeki MMP'lerin regülasyon mekanizmaları ve MMPlerin immunomodülatör foksiyonları nispeten bilinmemektedir. Eozinofiller, dolaşımdaki lökositlerin küçük bir popülasyonunu oluşturduğu için, bu çalışmada Eol-1 insan eozinofilik lösemi hücre hattı kullanılmıştır. Genel olarak PRR'lerin ve özellikle de NLR'lerin MMP'ler üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ilk olarak NLRC4 ve NLRP3 inflamazom aktifleşmesine yol açan iki sinyal (1. Sinyal olarak PAM3CSK4-TLR2 ligandı, 2.sinyal olarak ise hücre içerisine transfekte edilen bakteri flagellası) ile uyarılan Eol-1 hücrelerinin MMP-2 ve MMP-9'un hem enzim aktivitesi hem de mRNA ve protein seviyeleri analiz edildiğinde, Eol-1 hücrelerinin MMP-2 ve MMP-9'u hem mRNA hem de protein seviyesinde eksprese ettiği gözlenmiştir. Eol-1 hücrelerinde NLRC4 inflamazom aktivasyonu MMP-9 ekspresyonunu anlamlı bir şekilde arttırıyorken, MMP-2 mRNA ve protein ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik yapmadığı gözlemlenmiştir. Eol-1 hücrelerinde NLRC4 inflamazom aktivasyonunun neden olduğu kadar olmasa da NLRP3 inflamazom aktivasyonunun da MMP-9 mRNA ekspresyonunu arttırdığı gözlenmiştir. Ayrıca, hücre dışına salgılanan MMP-2 ve MMP-9'un enzim aktivitesi analiz edildiğinde, NLRC4 inflamazom aktivasyonunun hücre dışına salgılanan MMP-9 aktivitesini arttırdığı gözlemlenmiştir. Ancak ilginç bir şekilde MMP-2 aktivitesi ne bazal seviyede ne de inflamazom aktivasyonu sonrasında gözlenmemiştir. Rekombinant IL-1β (10 ng) ile stimüle olan Eol-1 hücrelerinde MMP-9 protein ekspresyonu artarken, hücre dışına salgılana MMP-9 aktivitesinin az da olsa arttığı görülmüştür. Eol-1 hücrelerinde, TLR2 stimülasyonu MMP-9'un doku inhibitörü olan TIMP-1'in mRNA eksresyonunu arttırırken NLRC4 inflamazom aktivasyonu TIMP-1 ekspresyonunu değiştirmemiştir. Buna ek olarak, NLRP3 inflamazom aktivasyonu TIMP1 mRNA ekspresyonunu azaltmıştır. Bunlara ek olarak, MMP-9'un NLRC4 inflamazomu aracılığı ile regüle olduğunu doğrulamak amacıyla, kaspaz-1 Z-VAD-FMK ile inhibe edildiğinde, NLRC4 inflamazom aktivasyonunun indüklediği MMP-9 protein ekspresyounun ve aktivasyonun azaldığı gözlemlenmiştir. Cevap aradığımız sorulardan birisi NLRC4 inflamazom aktivasyonu sonucu üretilen MMP-9'un, IL-1β üretimi ve olgunlaşmasında bir rolü olup olmadığıdır. Bu bağlamda, TLR2 ligandı ve NLRC4 inflamazom aktivasyonunun neden olduğu olgunlaşmış IL-1 β ekspresyonu ve hücre dışına salgılanmasının GM6001 MMP inhibitörü ile azaldığını ve kazpaz-1'in Z-VAD-FMK ile inhibe edildiğinde ise neredeyse tamamen yok olduğunu göstermiş olduk ki bu, kaspaz-1 Eol-1 hücrelerinde IL-1β olgunlaşmasında major bir protein olmasına rağmen MMP9'un daEol-1 hücrelerinde IL-1β olgunlaşmasında rolü olduğunu göstermektedir. Bunlara ek olarak, bir protein sentezi inhibitörü olan sikloheksimidin, Eol-1 hücrelerinde MMP-9 protein ekspresyonunu doza bağlı azaltıyorken hücre dışına salınan MMP-9 aktivitesini azaltmadığı, NLRC4 inflamazom aktivasyonu kaynaklı MMP-9 protein ekspresyonunu azaltmadığını ve Eol-1 hücrelerinden salınan MMP-9 aktivitesini tamamen ortadan kaldırmağı da elde ettiğimiz bulgulardan birisidir. Bunun da granüllerdeki MMP-9'un hücre dışarısına degranülasyon yolu ile salgılanmasının bir sonucu olduğu ve bir degranülasyon belirteci olan CD63'ünde NLRC4 inflamazom aktivasyonu sonucu arttığı elde edilmiş olup bu da MMP-9'un granüllerden degranülasyon sonucu salgılandığını doğrular niteklikte bir bulgudur. Mevcut verilere dayanarak, hava yolu inflamasyonu, alerjik yanıtlar ve parazit enfeksiyonlarında fonksiyonel rollere sahip olan eozinofillerde MMP-9'un sadece TLR'ler aracılığıyla değil aynı zamanda NLR'ler aracılığıylada da regüle olduğu, NLRC4 inflamazom aktivasyonunun Eol-1 hücrelerinde MMP-9'u, eozinofil hücre degranülasyonunu ve aktivasyonunu arttırması nedeniyle PRR'lar ile eozinofillerdeki MMP'lerin immünomodülatör işlevleri arasındaki ilişkinin anlaşılması için daha ileri araştırmalara potansiyel hedefler sunmaktadır.
Özet (Çeviri)
The immune system is a complex and dynamic network of cells, tissues, organs, molecules and soluble factors which fight aganist a broad range of pathogenic microorganisms to protect the body from infections. Besides its protective roles against pathogens, the immune system has the ability to clear allergenic substances and cancer cells in the body therefore, it also plays a central role in tissue remodeling. The immune system is divided into two categories: innate and adaptive immunity which are interconnected. The innate immunity is the first line of defense mechanism which develops nonspecific and rapid responses, while adaptive immunity results in specific responses to pathogens and may develop an immunological memory for a stronger and fasterresponse upon encounterance with the same pathogen. The innate immune system is made up of compelement proteins, specialized myeloid and lymphoid cells involving dendritic cells, macrophages, natural killer cells, eosinophils, basophils and neutrophils. These cells can recognize evolutionary conserved patters of pathogens known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through their pattern recognition receptors (PRRs). Upon recognition of PAMPs or damage-assosicated molecular patterns (DAMPs), PRRs activate downstream signaling pathways that ultimately induce innate immune responses by producing inflammatory cytokines. PRRs can be divided into 4 groups: Toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors (NLRs), C-type lectin receptors (CLRs), and RIG-I-like receptors (RLRs). Among them, TLRs and CLRs are membrane bound, while NLRs and RLRs are cytoplasmic PRRs. TLRs are a growing family of transmembrane receptors involved in innate immunity which has 10 identified members in humans. TLR2 recognizes microbial lipoproteins and glycolipids. TLR4 can sense lipopolysaccharides of gram-negative bacteria and TLR5 recognizes bacterial flagellin. The TLRs localized in subcellular compartments of the cell recognize nucleic acid material derived from viruses and bacteria. The NLRs are a cytosolic family of PAMP and DAMP sensors which have 22 members in humans. The NLRs consist of three domains: a C-terminal series of LRRs which recognize microbial molecules or danger signals, a central NACHT domain that facilitates NLR oligomerization and an N-terminal signaling domain. A significant subset of NLRs including NLRP1, NLRP3, NLRC4, NLRP6 are reported to assemble large protein complexes“Inflammasomes”which regulate the activation of caspases1 that leads to production of biologically inactive pro IL-1β, IL-18. Biologically active IL-1β and IL-18 promote inflammatory and antimicrobial responses and activate different helper T cell subsets such as TH1 and TH17 cells. The NLRP3 is one of the well characterized and most studied NLR which carries a PYRIN domain and inflammasome assembly upon ligand recognition by NLRP3 is critical for host immune defenses against bacterial, viral and fungal infections. Additionally, NLC4 has a CARD domain and forms an inflammasome complex in macrophages infected by bacterial pathogen components of type III secretion system(T3SS) or flagellin. Eosinophils are cells of innate immune system which constitute 1-6% of the circulating leukocytes. The number of eosinophils in the blood and some tissues is known to increase during specific immune responses to parasitic infections and in allergic diseases including in different types of asthma. As intracellular organelles, eosinophils contain numeroussecretory granules that are central to the functional responses of eosinophils. These granules are composed of major basic protein (MBP), eosinophil cationic protein (ECP), eosinophil peroxidase, eosinophil-derived neurotoxin (EDN), cytokines, chemokines, prostaglandins and matrix metalloproteinases (MMPs) which target parasites and potent toxins to airway epithelium. Through these granule contents, eosinophils have the potential to drive airway remodelling which is a dynanmic process of extracellular matrix (ECM) remodeling. MMPs and their tissue inhibitors of metalloproteinases have central roles in ECM remodeling. Of all the MMPs, MMP-2 and MMP-9 are the most studied MMPs. MMPs have widely been studied in asthma models and, MMP-9 is the predominant one in blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of patients with asthma. Recent studies also revealed the regulation of MMP-9 through TLRs in immune cells. Even though NLRs (NLRP3 and NLRC4) and inflammasomes are well studied in other contexts, their roles in shaping immunomodulatory functions of MMPs in eosinophils are relatively unknown. Since eosinophils constitute a minor population of circulating leukocytes, we used Eol-1 human eosniohilic leukemia cell line for the investigation of eosinophilic functions. We also expanded our work to primary human eosinophils isolated from peripherial blood which currently continues in our laboratory. To qualify the effects of PRRs in general and NLRs in particular on gelatinases, we first analyzed the activity and expression levels of MMP-2 and MMP-9 at both mRNA and protein level in Eol-1 cells upon NLRC4 and NLRP3 inflammasome activation based on the two signal rule in which the PAM3CSk4 was utilized as TLR2 ligand (signal 1) and intracellular flagella as NLRC4 ligand (signal 2), We observed that EoL-1 cells expressed MMP-2 and MMP-9 both at mRNA and protein level and NLRC4 inflammasome activation markedly elevatedthe expression of MMP-9, while the MMP-2 mRNA expression was slightly increased and protein expression did not significantly change. Moreover, NLRP3 inflammasome activation also increased MMP-9 mRNA and protein expressions however the effect of NLRC4 activation was more dramatic than the effects of NLRP3 activation on MMP9 expression We also examined the enzymatic activity of gelatinases secreted from Eol-1 cells upon NLRC4 and NLRP3 inflammasome activation. MMP-9 gelatinase activity was detected in cell-free medium of Eol-1 cells and augmented with NLRC4 inflammasome activation. Interestingly, MMP-2 activity was not detected. The NLRP3 inflammasome activation also induced MMP-9 gelatinase activity to a lesser extent than NLRC4 stimulants We also demonstrated that treatment with recombinant human IL-1β increased MMP-9 protein expression and MMP-9 gelatinase activity in Eol-1 cells. Next, we assessed the the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) TIMP-1 and TIMP-2 and determined thatTIMP-1 expressed in EoL-1 eosinophils, however, TLR2 stimulation rather than NLRC4 inflammasome activation may be involved in the regulation of TIMP-1 Moreover, to verify the regulation of MMP-9 through NLRC4 inflammasome, we treated EoL-1 eosinophils withcaspase-1 inhibitor Z-VAD-FMK which reduced NLRC4 induced MMP-9 protein expression and activation as MMP inhibitor GM6001 did. There are studies reporting the role of MMP-9 in IL-1β processing. We have shown that TLR2 and NLRC4 inflammasome increased the mature IL-1 β expression and IL-1β secretion was reduced by MMP and caspase-1 inhbitor indicating the importance of MMP-9 in IL-1 β maturation. Furthermore, cycloheximide a protein synthesis inhibitor did not alter the NLRC4 -induced MMP-9 expression and indicating that the synthesis of MMP9 is not de novo and it is from thepre-synthesized MMP-9 in granules. We then confirmed this obsertvation by measuring the CD63 expression, a degranulation marker, by flow cytometer. CD63 is present within granules and undergoes secretion by piecemeal degranulation or exocytosis in response to stimuli. Additionally, the increase in MMP-9 expression and activity upon NLRC4 inflammasome activation also corraletes with increase in CD147 expression known as extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). On the basis of current data, MMP-9 is involved in a wide range of cellular activities including airway inflammation, allergic responses and parasitic infections might be regulated not only via TLRs but also NLRs. Here, we report that NLRC4 inflammasome activation increased MMP-9 expression and activity, eosinophil degranulation and therefore contributed to the functions of Eol-1 cells. Taken together, our findings present potential targets for further investigations in immunomodulatory functions of MMPs in eosinophils and eosinophilic inflammation coupled with a PRRs.
Benzer Tezler
- Akciğer kanserli olgularda serum ve bronkoalveolar lavaj sıvısında matriks metalloproteinaz-2 ve matriks metalloproteinaz doku inhibitörü-2 düzeylerinin tümör belirleyicisi olarak değerlendirilmesi
Evaluation of levels of serum and brochoalveolar lavage fluit matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 as tumor markers of lung cancer subjects
DEFNE ÖZBEK
- Deneysel tip 2 diyabette gelişen vasküler hasar ve kardiyomiyopatide sglt2 inhibitörü ile tedavide sirtuinlerin rolü
The role of sirtuins in treatment with sglt2 inhibitor in experimental type 2 diabetes with vascular damage and cardiomyopathy
ÜMRAN KIZRAK
Doktora
Türkçe
2023
Eczacılık ve FarmakolojiEge ÜniversitesiFarmakoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZELİHA KERRY
DOÇ. DR. GÖNEN ÖZŞARLAK SÖZER
- Sistemik isotretinoin kullanan akne vulgaris hastalarında inflamatuar belirteçlerin değerlendirilmesi
Evalution of inflammatory markers in acne vulgaris patients using systemic isotretinoin
MAHİR DIĞIŞ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2022
DermatolojiSivas Cumhuriyet ÜniversitesiDeri ve Zührevi Hast. Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA TOSUN
- Meme kanserinde RUNX2'nin bazı hücrelerarası matriks proteinleri ve enzimleri üzerine etkisi
Effect of RUNX2 on some extracellular matrix proteins and enzymes in human breast cancer
SEVGİ BİNAY
- Adamts-8, ADAMTS-9, adamts-15 genlerinin psoriatik artrit patogenezindeki rollerinin ve moleküler mekanizmalarının araştırılması
Investigation of the roles and molecular mechanisms of ADAMTS-8, ADAMTS-9, ADAMTS-15 genes in the pathogenesis of psoriatic arthritis
MEHMET ALİ TEKİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Tıbbi BiyolojiDicle ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SEVGİ İRTEGÜN KANDEMİR