Isolation and characterization of the gene encoding d-lactate dehydrogenase enzyme from bacteroides fragilis that is known to be localized in colon cancer tissues
Kolon kanseri dokularında yerleştiği bilinen bacteroıdes fragılıs in d-laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu ve karakterizasyonu
- Tez No: 343866
- Danışmanlar: PROF. DR. DİLEK TURGUT BALIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Mikrobiyoloji, Biochemistry, Bioengineering, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 119
Özet
Bacteroides fragilis çalışmaları uzun süredir devam etmektedir ve yakın geçmişte yapılan çalışmalar Bacteroides fragilis?in dünya genelindeki en yaygın üçüncü kanser türü olan kolorektal kanseri ile ilişkisini göstermektedir. Bacteroides fragilis insanlara yararlı olan nantoksijenik ve hastalık yapan enterotoksijenik olmak üzere iki farklı soy altında sınıflandırılmaktadır. Dünya genelindeki Bacteroides fragilis infeksiyonlarına karşı antibiyotik direncinin olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle, bakteri infeksiyonlarıyla savaşmak için yeni yaklaşımlar bulunmasına yönelik çalışmaların yapılması zorunludur. Bu tez çalışmasında, enterotoksijenik Bacteroides fragilis metabolizmasının, bakteri anaerobik metabolizmaya sahip olduğu için, D-laktat dehidrogenaz enziminin hedeflenmesiyle durdurulması amaçlanmıştır. L-laktat dehidrogenaz Bacteroides fragilis genomunun tamamında araştırılmıştır. Bakteri genomunda L-laktat dehidrogenaz varlığının bildirilmesine rağmen, bu çalışmadaki bulgular Bacteroides fragilis?te L-laktat dehidrogenaz enziminin olmadığını göstermektedir. Bu çalışmaya kadar enterotoksijenik Bacteroides fragilis?e ait D-laktat dehidrogenaz enziminin gen dizisi belirlenmemiştir. Literatürde ilk kez D-laktat dehidrogenaz klonlanmış ve aktif protein halinde ifadesi yapılmıştır. Nantoksijenik Bacteroides fragilis?in D-laktat dehidrogenaz enzimi de pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır ve klonlanan her iki gen başlama ve sonlanma kodonu dahil 1011 baz çiftinden oluşmaktadır. Her iki gen farklarına göre kıyaslanmıştır; nükleotid düzeyinde on bir farkın ve amino asit düzeyinde üç farkın olduğu bulunmuştur. Bacteroides fragilis D-laktat dehidrogenaz enzimi C-terminalinde 6 Histidin aminoasidi bulunan pLATE31 vektörüne klonlanmıştır ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde 37.6 kDa?luk bir protein olarak ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Hücrelerin 0.1 mM IPTG ile indüklendiği ve 25°C?de 5 saat geliştirildiği koşullar en iyi ekspresyon koşulları olarak belirlenmiştir. Enzimi saflaştırmak için Ni-NTA agaroz kolonlar kullanılarak affinite kromatografisi yöntemi uygulanmıştır. Proteinin SDS-PAGE ile analizi 19.8 mg/litre ile yüksek miktarda ve %95?in üzerinde saflıkta elde edildiğini göstermiştir. Kinetik karakterizasyon pH: 7.5, 25°C?de gerçekleştirilmiştir. Grafit 3.0 programı saflaştırılan enzimin staedy state kinetik parametrelerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Piruvat substrat olarak kullanıldığında sırasıyla Vmax 0.1594, Km 0.3752 mM, kcat 32.4 s¯¹,kcat/km 86.35 mM¯¹s¯¹, değerleri bulunmuştur. Bu parametreler çalışılan enzim için ilk kez belirlenmiştir. Bacteroides fragilis D-laktat dehidrogenaz enziminin homoloji modellemesi aynı enzimin kristal yapısı bilinen Lactobacillus helveticus türü kalıp alınarak gerçekleştirilmiştir. Oluşturulan model ile ayrıca moleküler yerleştirme çalışmaları yapılmıştır. Bacteroides fragilis enfeksiyonlarını tedavide kullanılan bir antibiyotik olan Mezlocillin, NADH halkasına en uygun bileşik olarak belirlenmiştir. Bütün bu bulgular ileride yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarına uygun olarak, kolon kanseri ile ilişkili olduğu bilinen Bacteroides fragilis enfeksiyonları ile savaşmak için enzim inhibitörlerinin geliştirilmesinin önünü açacaktır.
Özet (Çeviri)
Bacteroides fragilis have been studied for years and more recent studies show association of Bacteroides fragilis with colorectal cancer, which is the third most common cancer worldwide. This bacterium could be grouped under two different strains; nontoxigenic, beneficial to humans, and enterotoxigenic, responsible for the diseases, Bacteroides fragilis. Antibiotic resistance against Bacteroides fragilis infections throughout the world was reported. Therefore, it is essential to work on finding new approaches to combat bacterial infections. In this thesis study, inhibition of enterotoxigenic Bacteroides fragilis metabolism was aimed through targetting D-lactate dehydrogenase enzyme as the bacterium has anaerobic metabolism. L-lactate dehydrogenase was searched in the complete genome of Bacteroides fragilis. Despite the report of presence of L-lactate dehydrogenase in it?s genome, evidences are presented in this study that there was no L-lactate dehydrogenase enzyme in Bacteroides fragilis. Gene sequence of enterotoxigenic Bacteroides fragilis D-lactate dehydrogenase was not determined up to this study. D-lactate dehydrogenase was cloned and expressed as active protein for the first time in literature. Nontoxigenic Bacteroides fragilis D-lactate dehydrogenase was also cloned into pGEM-T Easy vector and both cloned genes were composed of 1011 base pairs including start and stop codons. Both genes were compared for differences; there was an eleven difference at nucleotide level and three at the amino acid level. Bacteroides fragilis D-lactate dehydrogenase gene was subcloned into pLATE31 vector having C-terminal 6 histagged sequence and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells as a 37.6 kDa protein. The best expression conditions were determined as induction of cells with 0.1 mM IPTG, and growing the cells at 25°C for 5 hours. Affinity chromatography method was used for purifying the enzyme with Ni-NTA agarose column. SDS-PAGE analysis of protein showed presence of high quantity of protein at 19.8 mg/liter with the purity of over 95%. Kinetic characterization was performed at pH: 7.5, 25°C. Grafit 3.0 program was used to determine staedy state kinetic parameters of the purified enzyme. Vmax, Km, kcat, kcat/km, was found to be 0.1594, 0.3752 mM, 32.4 s¯¹, 86.35 mM¯¹s¯¹, respectively, by using pyruvate as substrate. These parameters were also determined for the first time from this enzyme. Homology modelling of Bacteroides fragilis D-lactate dehydrogenase was performed using the same enzyme?s crystal structure from Lactobacillus helveticus as template. This study was followed by molecular docking studies using this proposed model. Mezlocillin, one of the antibiotics used to treat Bacteroides fragilis infections, was found to fit the best into the NADH pocket. All these findings may enable the application of structure based drug design studies towards development of enzyme inhibitors to combat Bacteroides fragilis infections known to be related with colon cancer.
Benzer Tezler
- Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu, klonlanması ve analizi
Isolation, cloning and analysis of the gene encoding lactate dehydrogenase enzyme from Fusobacterium nucleatum
EMRAH SARIYER
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK BALIK
- Sütçüler kekiği (Origanum minutiflorum)'nde 1-deoksi-d-ksilüloz 5 fosfat redüktoizomeraz (DXR) ve terpen sentaz genlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu
Isolation and characterization of 1-deoxy-d-xylulose 5 phosphate reductoisomerase (DXR) and terpene synthase genes in Sütçüler oregano (Origanum minutiflorum)
CİVAN ÇELİK
Doktora
Türkçe
2023
ZiraatIsparta Uygulamalı Bilimler ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YAŞAR KARAKURT
- Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach
FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
DR. GÜNSELİ KURT GÜR
- Anoxybacillus kestanbolensis AC26 Sarı ribulokinaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of ribulokinase from Anoxybacillus kestanbolensis AC26 Sari
MÜSLÜM TOKGÖZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SABRİYE ÇANAKÇI
- Anoxybacillus kestanbolensis ac26 sarı l-arabinoz izomeraz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characteisation of l-arabinoseisomerase from anoxybacillus kestanbolensis ac26 sari
NAZAN DALKIRAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SABRİYE ÇANAKÇI