P35S, TNOS and PFMV targeted multiplex PCR using a single dye
Tek boya kullanarak P35S, TNOS ve PFMV hedefli çoklu PZR
- Tez No: 352361
- Danışmanlar: DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY, DR. MUSTAFA KOLUKIRIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 101
Özet
Genetik mühendisliği teknikleri ile modifiye edilen veya üretilen besin bitkileri geleneksel olarak genetiği değiştirilmiş (GD) bitkiler veya genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) olarak isimlendirilir. Genetiği değiştirilmiş bitkilerin ekim alanları 1996 yılından 2012 yılına 100 kat artarak, GD bitkileri yakın tarihimizin en hızlı uyum sağlanan ürün teknolojisi haline getirmiştir. Farklı kurumsal yapıların ve araştırmacıların çalışmaları incelendiğinde genetiği değiştirilmiş organizmaların insan sağlığı ve çevre üzerine riskleri ile ilgili farklı sonuçların ortaya konulduğu görülmektedir. GD bitki ve ürün çeşitlerinin varlığının ve miktarının izlenmesi ve doğrulanması için düzenleme ihtiyacı GD bitki ve ürünlerin dünya çapında marketlerde görülmesi ile artmıştır. Bu nedenle, bitki ve bitki ürünlerinde GDO çeşitlerinin tespiti için güvenilir, hızlı ve düşük maliyetli methodların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. GDO analizinde ilk adım genellikle GDO' larda bulunan promotör veya terminatörler bölgelerinin taranmasıdır. GDO pozitif olarak tespit edilen örnekler üzerinde daha sonra kalitatif ve kantitatif olay spesifik ileri analizler pozitif tespitin kontaminasyondan kaynaklanmadığından emin olunması için gerçekleştirilmelidir. Bu durum GD ürünlerin etiketlenmesi için tanımlanmış eşik seviyelerinin olduğu ülkelerde de ciddi bir öneme sahiptir. Eş zamanlı PZR GDO tespiti ve kantifikasyonu için en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknik ile hedef genin çoğalması, floresan boyalar kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. En sık kullanılan floresan boyalar oligonükleotid problar, yüksek çözünürlükte erime boyaları ve DNA bağlama boyalarıdır. En spesifik tespit sadece hedef dizilerine bağlanan oligonükleotid problar kullanılarak yapılabilir. Bu nedenle yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen floresan boyalardır. DNA bağlama boyaları ve yüksek çözünürlükte erime boyaları çift iplikli DNA molekülüne bağlanırlar. DNA bağlama boyaları belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR `ı inhibe edebililir. Yüksek çözünürlükte erime boyalarının minimum PZR inhibisyon etkisi vardır. Ayrıca yüksek çözünürlükte erime boyaları DNA bağlama boyaları ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü elde edilir. Eş zamanlı PZR ile GDO tespitinde en çok hedeflenen diziler karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); karnabahar mozaik virüse ait 35S terminatorü (t35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (FMV); Agrobacterium tumefacien?e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS), nopalin sentaz promotörü (pNOS) ve 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate sentaz (epsps) geni; Streptomyces hygroscopicus?a ait bar geni (BAR); Streptomyces viridochromogenes?a ait phosphinotricin-Nacetyltransferases (pat) genleridir. Bu çalışmada, GDO' lu bitkilerin %99 'undan fazlasının içerdiği karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (pFMV); Agrobacterium tumefacien?e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS) dizilerinin aynı anda tespiti için tek bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası kullanılarak çoklu eş zamanlı PZR methodu geliştirildi. Farklı PZR ürünleri arasındaki ayrım hedef DNA' ların erime sıcaklıkları farklılıklarına dayalı olarak yapılmıştır. Ayrıca, bu elementlerin taranması için gerekli olan toplam analiz süresini kısaltmak için enzim içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. PZR tabanlı metodolojilerde hassas ve etkili sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli DNA gereklidir. Bu çalışmada, yüksek miktarda ve kalitede DNA elde etmek için soya ve mısır örnekleri üzerinde 5 farklı silika kolon tabanlı DNA ekstraksiyon protokolleri denenmiştir. Protokollerin üçü enzimatik adımlara dayanırken diğer 2 protokol ise tamamen kimyasal ve fiziksel hücre parçalama yöntemine dayanmaktaydı. Yöntemlerin hepsinde guanidin tiyosiyanat PZR inhibitörü inaktivasyonu ve DNA bağlanması için bir kaotropik ajan olarak kullanılmıştır. GDO tespiti için mevcut DNA ekstraksiyon metodolojileri en az 1,5 ?g DNA ve 1.6 ve 2.0 arasında A260/280 oranı ile sonuçlanmalıdır. Tüm geliştirilmiş methodlardan elde edilen DNA ekstraktların A260/280 oranı istenilen aralıkta elde edildi. Tüm protokoller ile minimum limitden en azından 10 kat daha fazla olan 15 ?g? dan daha fazla DNA elde edildi. DNA konsantrasyonu açısından en iyi sonuçları boncukla homojenizasyon ve hekzasetiltrimetil amonyum bromür (STAB) muamelesi içeren protokollerden elde edilmiştir. Proteinler 280 nm? de absorbladığı için A260/A280 oranı DNA ektraktlarındaki proteinlerin varlığının hesaplanmasında kullanılır. Diğer taraftan, karbonhidratlar, fenoller, aromatik bileşikler ve ağır metaller gibi diğer tip PZR inhibitörlerinin varlığı da PZR sonuçlarını etkileyebilir. Karşılaştırmalı olarak eş zamanlı PZR verimliliğine farklı protokoller ile elde edilen DNA kalitesinin etkisini değerlendirmek için her protokolden aynı miktarda DNA kullanılarak eş zamanlı PZR gerçekleştirildi. Eş zamanlı PZR çalışmalarında genel bitki kloroplast DNA' sını hedefleyen PZR primerleri kullanıldı. DNA konsantrasyonu ve saflığı farklı protokollerden elde edilen tüm seyreltilmiş DNA' lar için aynı olması nedeniyle elde edilen Ct değerleri PZR inhibitörlerinin varlığına işaret etmiştir. Tüm DNA örnekleri bitki kloroplast DNA' sına spesifik erime sıcaklığında pik vermiştir. Boncuk ile homojenizasyon ve STAB muamelesini içeren protokoller ile elde edilen DNA' lardan elde edilen eşik döngüsü değerleri diğer protokollere göre yaklaşık olarak 2 döngü daha düşük olarak bulunmuştur. Bu durum PZR inhibitörlerinin elimine edilmesinde bu iki protokolün daha başarılı olduğunu gösterdi. Bu iki protokol arasındaki fark proteinaz K muamelesi adımının dahil edilmesidir. DNA izolasyonu için gerekli olan maliyet ve toplam süreyi azal°ak amacıyla proteinaz K içermeyen protokol seçildi. FMV, NOS, 35S pozitif referans gıda örnekleri akredite gıda kontrol laboratuarları tarafından temin edilmiştir. FMV, NOS, 35S pozitif gıda örneklerinden çıkarılan DNA? lar hedef spesifik primer çiftleri kullanılarak çoğaltıldı. Amplifikasyon döngülerinden sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirildi ve hedeflenen PZR ürünlerinin Tm' leri hesaplandı. Hedef spesifik erime pikleri NOS spesifik reaksiyon için 73 ± 0.38?C' de, FMV spesifik reaksiyon için 80?C ± 0.28?C' de, 35S spesifik reaksiyon için 82.26 ± 0.29?C' de ve bitki kloroplast DNA' sına specifik reaksiyon için 82 ± 0.33?C' de elde edildi. Genellikle aynı amplikon için Evagreen kullanılarak yapılan eş zamalı PZR ile elde edilen erime sıcaklıkları 0.5 ve 1 ?C arasında değişebileceği kabul edilmektedir. Bu çalışmada elde edilen standart sapmalar 0.4? C ?den daha düşük bulunmuştur. Ayrıca, bütün Evagreen eş zamanlı PZR reaksiyonları önemli ek amplifikasyon ürünleri olmadan tek bir spesifik sinyal üretmiştir. Eş zamanlı PZR kantifikasyon standatları referans örneklerin purifiye edilmiş PZR ürünleri kullanılarak hazırlandı. Seri dilüsyonlar hedeflenen genin 100-1010 kopyasını içeren standart örnekler hazırlanması için yapıldı. Tespit limitini elde etmek için gr örnek başına 1-100 kopya 35S ve NOS içeren soya örnekleri ve gr örnek başına 1-100 kopya FMV içeren mısır örneği hazırlandı. 35S, FMV, NOS hedefli methodolojiler için tespit limiti 1 gen kopya/gr gıda örneği olarak bulunmuştur. Ancak bu çalışmada standart karışımlar referans gıda kontrol laboratuvarından elde edilmediği için methodların tespit limitleri geçek tespit limitlerinin sadece kaba tahminleridir. 35S, NOS ve FMV kalıplarının DNA karışımı primerlerin spesifikliğini test etmek için hazırlanmıştır. DNA karışımı her spesifik primer çifti ile eş zamanlı PZR ile çoğaltıldı. Eş zamanlı PZR reaksiyonlarının spesifikliği tüm amplifiye PZR ürünlerinin sekanslanması ile incelenmiştir. Sonuçlar çoğaltılmış dizilerin amaçlanan hedeflere en az %99 benzer olduğunu göstermiştir. İlk olarak dubleks eş zamanlı PZR denemeleri her farklı DNA kalıplarının aynı miktarda eklenmesi ile gerçekleştirildi. Dubleks reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünleri ile sonuçlanan daha fazla tercih edilen DNA kalıpları erime eğrisi analizi ile tespit edildi. FMV kalıplarından reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünü elde edildi. 35S kalıpları ise 35S ve NOS kalıpları içeren PZR' larda daha fazla tercih edildi. Dubleks PZR' larda farklı ilk örnek miktarının etkisini belirlemek için sadece tek bir tip Tm piki elde edene kadar çalışmalara devam edildi. Genel sonuçlar iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları altında elde edilemezken iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları üzerindeki her hedef için elde edilebildiği gösterildi. Başarılı ikili karışım denemelerinden sonra her bir referans örnekten 1000 kopya kullanılarak üçlü karışım hazırlandı. Üç primer çiftinin çoklu eşmanalı PZR' da beraber çalışabildiğini göstermek ve spesifik olmayan PZR ürünü veya primer dimeri oluşturmadığını göstermek için üçlü eş zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirildi. Üçlü kombinasyonlar referans örneklerin 1/1/1 röfatif kopya sayısı oranına uygulanmıştır. NOS, FMV ve 35S spesifik çoklu eş zamanlı PZR 3 farklı erime piki elde edilmesi ile sonuçlandı. NOS, FMV ve 35S hedeflerine karşılık gelen erime pikleri sırasıyla 73.04±0.13?C, 80.21±0.10?C ve 82.15±0.08?C' de gözlenmiştir. Çoklu reaksiyonlarda ek amplifikasyon gözlenmemiştir. Bitki DNA' ları her zaman GDO tarama reaksiyonlarda baskın hedef olacağından, bitki DNA' ları FMV, 35S ve NOS hedeflerinin tespit hassasiyetini artırmak için ikili ve üçlü DNA karışımlarına dahil edilmemiştir. Bitki spesifik eş zamanlı PZR' lar GDO taraması reaksiyonlarında pozitif PZR amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmıştır. Daha önce akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından analiz edilen ham ve işlenmiş gıda örnekleri geliştirilen metodoloji kullanılarak tekrar analiz edildi. Köfte, soya yağı, soya unu, mısır, mısır yağı, don yağı, kedi ve köpek mamaları, çikolata, baklava ve ekmek çeşitlerini içeren toplam 96 örnek analiz edildi. Sonuçlarımız akredite gıda kontrol laboratuvarlarında elde edilen sonuçlar ile %100 uygumludur. Bu çalışma tek bir yüksek çözünürlükte erime boyası kullanılarak 35S, NOS ve FMV bölgelerinin eş zamanlı çoklu tespitinin mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca enzimatik olmayan hücre parçalama yöntemlerini kullanarak yüksek kalitede DNA elde edilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
Food plants that are being produced or modified by genetic engineering techniques are conventionally named as genetically modified (GM) crops or genetically modified organisms (GMOs). The investigations have revealed different results on the risks of GMOs on human health and the environment. The regulatory need to monitor and verify the presence and the amount of GM varieties in crops and products has increased with the release of GM crops and products in the markets worldwide. Therefore, there is a need to develop reliable, quick and cost-effective methods for the detection of GM varieties in crops and their products. Screening for the GMO promoters or terminators is usually the first step for GMO analysis. The subsequent event specific qualitative and quantitative GMO analyses must be carried on the GMO positive samples to ensure that the detected GMOs were not originated from the contaminations. This has a substantial importance in countries where the quantitative threshold levels were defined for labeling of the GM products. In this study, we developed a multiplex QPCR methodology using a single high resolution melting dye to simultaneously detect Cauliflower Mosaic Virus 35S (35S) promoter, Agrobacterium tumefaciens Nopalin Synthase (NOS) terminator and Figworth mosaic virus 35S (FMV) promoter, which are contained in more than 99% of the GMO events. Discrimination between the different PCR products was based on the differences in melting temperatures of the target DNAs. We also developed an enzyme free DNA extraction methodology for food samples to shorten the total analysis time necessary for the screening of these elements. High quality DNA is necessary to obtain sensitive and efficient results in PCR based methodologies. In this study, we tried 5 different silica column based DNA extraction protocols on soybean and maize samples to obtain DNA with high quantity and quality. Three of the protocols were based on enzymatic steps whereas the other two methods were completely based on the chemical and physical cell disruption methodologies. In all of the methodologies, guanidium thiocyanate was used for PCR inhibitor inactivation and as a catastrophic agent for DNA binding. The current methodologies of DNA extraction for GMO detection must result in at least 1.5 ?g DNA with A260/280 ratios between 1.6 and 2.0. A260/280 ratios of DNA extracts from all of the developed methods were in the desired range. All of the protocols were resulted in DNA amounts higher than 15 ?g DNA, which is at least 10x higher than the minimal limit. The best results in terms of DNA concentration were obtained from the protocols that include bead beating and CTAB treatment. Since proteins absorb at 280 nm, the ratio A260/280 is used to estimate the presence of the proteins in DNA extracts. On the other hand, the presence of other types of PCR inhibitors such as carbohydrates, phenols, aromatic compounds and heavy metals may also affect the PCR results. To comparatively evaluate effect of the DNA quality obtained by different protocols on the QPCR efficiency, the same amount of template DNAs were used in QPCR. The universal plant chloroplast DNA targeted PCR primers were used in real time PCR trials. The obtained Ct values indicated the presence of PCR inhibitors because DNA concentrations and purities were the same for all the diluted templates obtained from different protocols. All of the templates were resulted in plant chloroplast DNA specific melting temperatures (Tm). Threshold cycle (Ct) values obtained using the protocols that include bead beating and CTAB treatment were approximately 2 cycles lower than the other protocols. This showed that these two protocols were more successful in eliminating the PCR inhibitors. The difference between these two protocols was the inclusion of proteinase K treatment step. To reduce the cost and total time necessary for the DNA isolation, we chose the protocol without proteinase K treatment. FMV, NOS, 35S positive reference food samples were supplied by the accredited food control laboratories. Extracted DNAs from FMV, NOS, 35S positive food samples were amplified by using the target specific primer pairs. Melting curve analysis was performed after the amplification cycles and Tm of the targeted PCR products were calculated. The target specific melting peaks were obtained at 73 ± 0.38?C for NOS, 80?C ± 0.28?C for FMV, 82.26 ± 0.29?C for 35S and 82 ± 0.33?C for plant specific reactions. It is generally accepted that the Tm obtained with Evagreen QPCR could vary between 0.5 and 1 ?C for the same amplicon. In this study, the standard deviations were lower than 0.4 ?C. In addition, all of the Evagreen QPCR reactions generated a single specific signal without major additional amplification products. QPCR quantification standards were prepared using the purified PCR products from the reference samples. Serial dilutions were done to obtain standard samples containing 100-1010 copies of the targeted gene. In order to obtain the limit of detection (LOD), soybean samples that contain 1-100 copies of 35S and NOS per gr of the sample, and maize samples that contain 1-100 copies of FMV per gr of the sample were prepared. The limits of detection were 1 gene copy/gr food sample for the 35S, NOS and FMV targeted methodologies. On the other hand, since the standard mixtures were not obtained from a reference food control laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs. A DNA mixture of the 35S, NOS, FMV genes were prepared to test the specificity of the primers. The DNA mixture was amplified via QPCR with each specific primer pair. The specificity of the QPCR reactions was examined via sequencing of the each amplified PCR product. The results showed that the amplified sequences have at least 99% similarity to the intended targets. The same amounts of the different DNA templates were added to the initial duplex QPCRs trials. Favored DNA templates, which resulted in more abundant PCR products in duplex reactions, were determined via melting curve analysis. The FMV templates resulted in more PCR products. The 35S templates were favored in PCRs that contained the 35S and NOS templates. The subsequent trials were carried out till only one type of Tm peak was obtained to determine the effect of different initial template amounts on the duplex QPCRs. The overall results showed that; two different Tm peaks were not obtained under 1/100 relative template concentrations but two different Tm peaks were obtained for each target above 1/100 relative template concentrations. After the successful binary mixture trials, triple mixture was prepared using 1000 copies of the each reference sample. Triplex QPCR trials were carried out to show that 3 primer pairs can work together in the multiplex QPCR and do not form non-specific PCR products or primer dimers. The triple combinations were applied to 1/1/1 relative copy number ratios of the reference samples. The NOS, FMV and 35S specific multiplex QPCR resulted in 3 different melting peaks. The melting peak corresponding to NOS, FMV and 35S targets were observed at 73.04±0.13?C, 80.21±0.10?C and 82.15±0.08?C, respectively. No additional amplification was observed in the multiplex reactions. Since plant DNAs will always be the dominant target in GMO screening reactions, plants DNAs were not included in the binary and triple DNA mixtures to increase the detection sensitivities of the FMV, 35S and NOS targets. Plant specific QPCRs were carried out in GMO screening reactions as a positive PCR amplification control. The raw and processed food samples, which were already analyzed by the accredited food control laboratories, were re-analyzed using the developed methodology. Total of 96 samples that include meatballs, soybean oil, soybean meal, corn, corn oil, tallow oil, cat and dog foods, chocolate, baklava and bread varieties were analyzed. Our results were in 100% accordance with the results obtained by the accredited food control laboratories. This study showed that multiple detection of 35S, NOS and FMV is possible using a single HRM dye. We also showed that it is possible to extract high quality DNA by using non-enzymatic cell disruption methodologies.
Benzer Tezler
- Türkiye'de piyasaya sunulan bebek mamalarında genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) varlığının araştırılması
Investigation of the presence of genetically modified organism (GMO) in baby foods presented to the market in Turkey
ERDEM ARTUVAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
Gıda MühendisliğiMersin ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. SALİH AKSAY
- Bazı soya genotiplerinin karyolojik ve moleküler karakterizasyonu ve GDO taraması
Karyological and molecular characterization of some soy genotypes and GMO screening
AHMET YASİN SEZER
- Mikrodalga uygulanan MIR604 ve MON810 mısır unlarının omik yaklaşım ile karakterizasyonu
Characterization of microwave-treated MIR604 and MON810 maize flours with omics approach
BEGÜM ZEYNEP HANÇERLİOĞULLARI
Doktora
Türkçe
2024
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. REMZİYE YILMAZ
- Development of PCR methods for detection and quantification of genetically modified maize
Genetiği değiştirilmiş mısırların tespiti ve miktar tayini için PZR yöntemleri geliştirilmesi
HOUMAN JABBARİFARHOUD
Doktora
İngilizce
2010
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Bölümü
DOÇ. DR. CANDAN GÜRAKAN
DR. REMZİYE YILMAZ
- Development of QCM based DNA biosensors for detection of genetically modified organisms
Genetiği değiştirilmiş organizmalar için işaretsiz saptama metodlarının geliştirilmesi
İREM KARAMOLLAOĞLU
Doktora
İngilizce
2007
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM