Geri Dön

Fusobacterıum nucleatum'un enolaz enzimini kodlayan genin klonlanması ve analizi

Cloning and analysis of the gene encoding enolase enzyme from fusobacterium nucleatum

PDF İndir

  1. Tez No: 355710
  2. Yazar: SİNEM YAKARSÖNMEZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. DİLEK TURGUT BALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Genetik, Bioengineering, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Fusobacterium nucleatum, enolaz, periodontal hastalıklar, kinetik karakterizasyon, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı, Fusobacterium nucleatum, enolase, periodontal diseases, kinetic characterization, structure based drug design
  7. Yıl: 2013
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 102

Özet

Fusobacterium nucleatum insanlarda periodontitis, gingivitis gibi periodontal hastalıklara neden olmaktadır. Ayrıca F. nucleatum oral mikrobiyomda bulunan yaygın türlerden biri olup, oral floradaki diğer bakteriler ve konak epitelyal hücreler ile etkileşmektedir. Fusobacteria'larda antibiyotik duyarlılığının rapor edilmesi, bu türe karşı alternatif ilaçların geliştirilmesi gerektiğini göstermektedir. Enolaz F. nucleatum'un glikolitik yolağındaki, 2- fosfogliserik asidin (2-PGA) fosfoenol pirüvata (PEP) dönüşümü reaksiyonundan sorumlu enzimdir. Bakterinin metabolizmadaki rolünden dolayı F. nucleatum'un enolaz enzimi bu çalışmada hedef molekül olarak seçilmiştir. F. nucleatum enolaz enzimi literatürde ilk defa izole edilmiş, klonlanmış, eksprese edilmiş, kinetik ve yapısal olarak analiz edilmiştir. F. nucleatum enolazı (FnENO) kodlayan gen ilk olarak pGEM®-T Easy Vektör sistemine klonlanmıştır. Daha sonra Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde enzimin ekspresyonunun yapılması için pLATE 31 vektörüne alt-klonlaması yapılmıştır. Ni-NTA agarozu kullanılan affinite kromatografisi ile protein saflaştırılmasını sağlamak için proteinin C- terminal ucuna 6xHis-tag bölgesi eklenmiştir. Protein saflaştırma işleminden sonra 46,37 kDa olan proteinin SDS-PAGE analizinde enzimin, % 95'in üzerindeki yüksek saflıkta elde edildiği gösterilmiştir. Bu enzimin kinetik karakterizasyonu öncesinde optimum pH ve termostabilite analizleri yapılmıştır. FnENO enziminin optimum pH'ı 8,5 olarak bulunmuştur ve spesifik aktivitesi 57,14 U/mg olarak hesaplanmıştır. Termostabilite analizleri FnENO aktivitesinin 30-60 0C arasında stabil kaldığını göstermiştir. Kinetik analiz pH 8,5 ve 250C'de yapılmıştır. Saflaştırılmış FnENO enziminin kinetik parametreleri GraFit 3.0 kullanılarak belirlenmiştir. Kinetik değerler, 2-PGA substratının kullanılmasıyla Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1 olarak elde edilmiştir. Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin homoloji modellemesi Enterococcus hirae enolazının yapısı kalıp alınarak oluşturulmuş ve muhtemel ilaç hedef bölgeleri tanımlanmıştır. Tüm bu sonuçlar yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı doğrultusunda yeni görüşler ortaya çıkarabilecek ve enolaz, insandaki Fusobacterium nucleatum enfeksiyonlarını baskılamak için aday olabilecektir.

Özet (Çeviri)

Fusobacterium nucleatum is related to periodontal diseases such as gingivitis and periodontitis in human. It is also one of the prevalent species in the oral microbiome and interacts with other bacteria in oral flora and host epithelial cells. Antibiotic susceptibility in Fusobacteria has been reported, so this showed that development of alternative drugs against this species is required. Enolase is an enzyme which is responsible from a reaction in glycolytic pathway of F. nucleatum and converts 2-phosphoglyceric acid (2-PGA) to phosphoenolpyruvate (PEP). In this study, F. nucleatum enolase was chosen as a target molecule because of its role in the metabolism of the bacteria. The enzyme was isolated, cloned, expressed and analysed both kinetically and structuraly, for the first time in the literature. The gene encoding enolase from F. nucleatum (FnENO) was first cloned into pGEM®-T Easy Vector system and then sub-cloned into pLATE 31 vector for the expression of enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) cells. 6xHis-tag region was added to the C-terminal of the protein to enable purification of the protein by affinity chromotography using Ni-NTA agarose. SDS-PAGE analysis of the 46,37 kDa protein showed that the enzyme was obtained at high purity, over >% 95, following the protein purification process. Optimum pH and thermostability analyses were performed prior to kinetic characterization of the enzyme. It was found that the optimum pH was 8,5 for this enzyme and specific activity was calculated as 57,14 U/mg. Thermostability analyses showed that FnENO activity remained stable between 30-60 0C. Kinetic analysis was performed at pH 8,5 and 250C. Staedy state kinetic parameters of purified FnENO was determined using GraFit 3.0. Kinetic values were obtained using 2-PGA as substrate; Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1. Homology modelling of Fusobacterium nucleatum enolase enzyme was built using Enterococcus hirae enolase structure as template and possible drug target regions were described. All these results may open new insights towards structure based drug design studies and enolase may be a candidate molecule to combat Fusobacterium nucleatum infections in human.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    545959

    Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu, klonlanması ve analizi

    Isolation, cloning and analysis of the gene encoding lactate dehydrogenase enzyme from Fusobacterium nucleatum

    EMRAH SARIYER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    BiyomühendislikYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. DİLEK BALIK

  2. Tez No

    366004

    Defensinlerin periodontopatojenik biyofilm üzerine etkisi

    Effect of defensins on periodontopathogenic biofilms

    MUTLU KESKİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Diş Hekimliğiİstanbul Üniversitesi

    Periodontoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞEN GÜLDEN IŞIK

  3. Tez No

    812048

    Ülseratif kolit hastalığında fusobacterium nucleatum miktarının tümör nekroz faktör (TNF) alfa tedavisi üzerindeki etkilerinin araştırılması

    Investigating the effects of fusobacterium nucleatum levels on tumor necrosis factor (TNF) alpha therapy in ulcerative colitis disease

    BİLGE ŞENYÜZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Tıbbi BiyolojiEge Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SUNDE YILMAZ SÜSLÜER

  4. Tez No

    649960

    Kolorektal kanser tanısı alan ve almayan olguların kolon mikrobiyotasında enterotoksijenik bacteroides fragilis ve fusobacterium nucleatum kolonizasyonunun karşılaştırılması

    Comparison of enterotoxygenic bacteroides fragilis and fusobacterium nucleatum colonisation in colon microbiota of patients with and without colorectal cancer diagnosis

    YEŞİM ÖZTÜRK BAKAR

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HRİSİ BAHAR TOKMAN

  5. Tez No

    569296

    Yeşil yaprak uçucularının bağırsaklardaki 'iyi huylu' (Kommensal) ve 'kötü huylu' (Patojen) bakteriler üzerine uyarıcı ve baskılayıcı etkileri

    Stimulatory and inhibitory effects of green leaf volatiles on 'good' (Commensal) and 'bad' (Pathogenic) bacteria in the intestine*

    GAMZE GÖKER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    FizyolojiBurdur Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi

    Fizyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ AHU DEMİRTAŞ

Geri Dön